杜仲半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因EuCPI的克隆及功能分析*

張 普 邵文靖 杜克久,3 張 爽,3

1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 保定 071000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 保定 071000； 3.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點實驗室 保定 071000)

林木在生長過程中極易受到非生物環(huán)境脅迫和病蟲害的影響，這些不利因素嚴(yán)重制約著林木的生長發(fā)育，給我國生態(tài)環(huán)境建設(shè)造成極大破壞。近年來，張家口壩上地區(qū)楊樹(Populus)防護(hù)林退化面積達(dá)到 8.1萬hm2，占楊樹防護(hù)林總面積的79.5%，當(dāng)?shù)貧夂虻母珊祷厔菡侵饕蛑?鄭春雅等， 2018)?！叭薄狈雷o(hù)林第一、二期工程的楊樹防護(hù)林基本被光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)毀滅殆盡，后期再造防護(hù)林中光肩星天牛發(fā)生依然嚴(yán)重，導(dǎo)致 “三北”地區(qū)的生態(tài)環(huán)境進(jìn)一步惡化(楊忠岐等， 2018)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，抗逆基因林木的選育成為木本植物遺傳性狀改良的重要內(nèi)容之一，并發(fā)展成為現(xiàn)代生物技術(shù)研究領(lǐng)域的重要成果之一。

半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cysteine proteinase inhibitor, CPI)，又名巰基蛋白酶抑制劑，是一類可抑制半胱氨酸蛋白酶的超家族蛋白。CPI 是一個楔形構(gòu)型，由3部分組成： 位于中心區(qū)域的包含 Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly (Xaa代表任意氨基酸)保守基序組成的發(fā)夾環(huán), 能夠與半胱氨酸蛋白酶的活性位點相互作用； 位于碳末端的 Pro-Trp (或Leu-Trp)二肽基序，這2個殘基具有高度的疏水側(cè)鏈，與酶發(fā)生直接的相互作用； 位于氮末端的Gly-Gly殘基，影響 CPI 與蛋白酶的結(jié)合能力(Benchabaneetal.， 2010)。絕大多數(shù)CPI均具有通常位于蛋白序列中心區(qū)域的 QXVXG和PW基序(Van Wyketal.， 2016； Martinezetal.， 2005)，這些高度保守的特殊結(jié)構(gòu)影響半胱氨酸蛋白酶抑制劑與半胱氨酸蛋白酶的結(jié)合，在林木抵抗高溫、低溫、干旱、真菌、細(xì)菌、蟲害等脅迫中發(fā)揮重要的作用(Benchabaneetal.， 2010)。

CPI通過與半胱氨酸蛋白酶相結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)發(fā)生水解反應(yīng)，參與植物對逆境脅迫的應(yīng)答、衰老、細(xì)胞程序化死亡等生理過程，能夠提高植物對非生物脅迫的抵抗能力(張潔琳等， 2018； Szewinskaetal.， 2016)，經(jīng)低溫、高溫、干旱、鹽和ABA處理能夠誘導(dǎo)植物CPI的積累(Christovaetal.， 2006； Hwangetal.， 2010)。此外，CPI還是植物對昆蟲捕食防御反應(yīng)的重要組成部分，其產(chǎn)生受到信號傳導(dǎo)途徑的高度調(diào)節(jié)，該信號傳導(dǎo)途徑由掠食行為引發(fā)，通過傷口反應(yīng)進(jìn)行傳導(dǎo)，誘導(dǎo)產(chǎn)生CPI，并在傷口釋放進(jìn)入昆蟲體內(nèi)(Koiwaetal.， 1997)。半胱氨酸蛋白酶是鞘翅目(Coleoptera)昆蟲消化系統(tǒng)的重要消化酶，因此CPI具有抑制害蟲蛋白消化的能力，使害蟲生長發(fā)育遲緩，致其死亡(劉會香， 2006； 李盛楠， 2010)。目前有關(guān)植物CPI基因的研究主要集中于農(nóng)作物，林木CPI基因的報道較少，將農(nóng)作物來源的基因轉(zhuǎn)移到林木上可能會對基因功能的表達(dá)有一定局限性，尋找優(yōu)質(zhì)的林木來源的CPI基因具有重要科學(xué)意義(曹鑫等， 2011)。

杜仲(Eucommiaulmoides)隸屬于杜仲科(Eucommiaceae)，單科單屬單種，是一種特有的中藥和天然橡膠資源(杜紅巖， 2010)。杜仲具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，在我國很多地區(qū)均可栽培。已有關(guān)于杜仲抗真菌蛋白的分離及抗真菌活性研究，但從杜仲中分離兼有抗非生物脅迫功能的抗蟲基因的研究還鮮有報道。本研究從杜仲種仁中克隆出半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因，命名為EuCPI，對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時構(gòu)建pET28a-EuCPI原核表達(dá)載體在BL21(DE3)大腸桿菌(Escherichiacoli)宿主中誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE、Western Blot及蛋白純化試驗，并對原核表達(dá)的pET28a-EuCPI/BL21菌液進(jìn)行高溫脅迫、鹽脅迫及飼蟲試驗，初步探究EuCPI基因的功能，以期為EuCPI基因應(yīng)用于林木抗逆性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料： 杜仲種子由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點實驗室保存。

主要試劑和工具酶： pMD19-T Vector，SMARTer? RACE 5′/3′ Kit，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ，T4 DNA連接酶，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞來自TaKaRa公司； pET28a(+)載體由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點實驗室保存； RNA提取試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒來自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 EuCPI基因cDNA全長序列擴(kuò)增

1.2.1 杜仲種仁RNA提取與cDNA合成 用試劑盒EZ-10 DNAaway RNA Mini-Preps Kit提取RNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性，通過SMARTer? RACE 5′/3′ Kit試劑盒獲得樣品cDNA并保存于 -20 ℃冰箱備用。

1.2.2EuCPI基因中間區(qū)域擴(kuò)增 在NCBI查找植物CPI所編碼的氨基酸保守序列，結(jié)合DNAman 6和Primer Premier 5軟件設(shè)計1對引物BS-F和BS-R(表1)，以cDNA為模板通過PCR擴(kuò)增出EuCPI基因的中間一段序列。PCR反應(yīng)體系： cDNA 1 μL，引物BS-F和BS-R各1 μL(10 μmol·L-1)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，共計20 μL。反應(yīng)程序： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。將目的片段切膠回收后連接pMD19-T Vector送公司測序。

1.2.3EuCPI基因特異末端片段擴(kuò)增 根據(jù)EuCPI基因中間序列的測序結(jié)果分別設(shè)計用于3′-RACE和5′-RACE克隆的巢式PCR引物(表1)。3′-RACE第1輪巢式PCR反應(yīng)體系： cDNA 1 μL，引物3R-OUT和UMP-L各1 μL(10 μmol·L-1)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，共計20 μL。反應(yīng)程序： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。3′-RACE第2輪巢式PCR反應(yīng)體系： 第1輪產(chǎn)物稀釋10倍取 1 μL，引物3R-IN和UMP-S各1 μL(10 μmol·L-1)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，共計20 μL。反應(yīng)程序同第1輪。將目的片段切膠回收后連接pMD19-T Vector送公司測序。

5′-RACE第1輪巢式PCR反應(yīng)體系： cDNA 1 μL，引物5R-OUT和UMP-L各1 μL(10 μmol·L-1)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，共計20 μL。反應(yīng)程序： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。5′-RACE第2輪巢式PCR反應(yīng)體系： 第1輪產(chǎn)物稀釋10倍取 1 μL，引物5R-IN和UMP-S各1 μL(10 μmol·L-1)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，共計20 μL。反應(yīng)程序同第1輪。將目的片段切膠回收后連接pMD19-T Vector送公司測序。

1.2.4EuCPI全長序列預(yù)測和ORF擴(kuò)增 用DNAman軟件對中間序列、3′-RACE和5′-RACE的測序結(jié)果進(jìn)行拼接，預(yù)測EuCPI基因的cDNA全長序列，同時根據(jù)預(yù)測結(jié)果設(shè)計用于ORF擴(kuò)增的1對引物ORF-F和ORF-R(表1)。PCR反應(yīng)體系： cDNA 1 μL，引物ORF-F和ORF-R各1 μL(10 μmol·L-1)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，共計20 μL。反應(yīng)程序： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。將目的片段切膠回收后連接pMD19-T Vector送公司測序。

表1 EuCPI基因克隆的引物

1.3 EuCPI基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測ORF； 使用ProtParam tool(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析EuCPI蛋白的理化特性； 使用ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)預(yù)測親疏水性； 使用TMHMM(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0/)分析跨膜區(qū)； 使用Singnalp-5.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測EuCPI蛋白的信號肽； 使用SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html#opennewwindow)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)； 使用NCBI的Conserved Domains Database進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測； 通過SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org)對EuCPI氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源建模； 使用DNAman 6軟件對不同植物的CPI蛋白進(jìn)行比對； 使用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建

用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶分別對1.2.4中的ORF擴(kuò)增產(chǎn)物和pET28a(+)原核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，切膠回收后用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗證，陽性結(jié)果送公司測序。將測序正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，命名為pET28a-EuCPI/BL21，將pET28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞命名為pET28a/BL21。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將2種陽性菌株pET28a-EuCPI/BL21和pET28a/BL21分別接種在含50 μg·mL-1Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r·min-1過夜振蕩培養(yǎng)12 h，按照1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD600= 0.6，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別取誘導(dǎo)0、3、6 h和過夜誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE預(yù)試驗，篩選最佳誘導(dǎo)時間。

通過親和層析法進(jìn)行蛋白純化，具體步驟參考康為世紀(jì)的His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)說明書，洗脫時分別用10、20、50 mmol·L-1的咪唑洗脫液。Western Blot試驗的常規(guī)操作手法參照文獻(xiàn)(劉會香， 2006)，最后一步加入 10 mL 包含顯色底物(NBT、BCIP)的顯色液，室溫、避光靜置，觀察顏色反應(yīng)，達(dá)到要求后，清水漂洗，終止反應(yīng)，避光晾干。

1.6 EuCPI基因抗性試驗

1.6.1 鹽脅迫試驗 按照1.5的誘導(dǎo)方法，將誘導(dǎo)后的pET28a-EuCPI/BL21和pET28a/BL21菌液稀釋到OD600=0.6左右，再進(jìn)一步將菌液稀釋1 000倍，取20 μL分別涂于含50 μg·mL-1Kan的不同NaCl濃度的LB固體培養(yǎng)基上。NaCl終濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1 mol·L-1(不計算 LB 培養(yǎng)基本底 NaCl 濃度)，每種濃度的平板3次重復(fù)，37 ℃ 培養(yǎng)24 h后觀察菌落的生長情況。

生長曲線測定: 取0.1 mL誘導(dǎo)后稀釋至OD600=0.6的pET28a-EuCPI/BL21和pET28a/BL21菌液，接種至20 mL含0 mol·L-1和0.25 mol·L-1NaCl的50 μg·mL-1Kan的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)。0 mol·L-1NaCl濃度培養(yǎng)基作為對照組，每 2 h 取1次樣品測量OD600，每個測定樣品均重復(fù) 3 次，2次獨立試驗后用GraphPad Prism 8繪制生長曲線。

1.6.2 高溫脅迫試驗 培養(yǎng)基為含50 μg·mL-1Kan的LB 液體培養(yǎng)基，將處理好的菌液分別于37、42、50 ℃， 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)。其他操作方法同鹽脅迫生長曲線測定。

1.7 EuCPI菌液飼蟲試驗

將黃粉蟲(Tenebriomolitor)老熟幼蟲置于人工培養(yǎng)箱內(nèi)，用經(jīng)過滅菌的麥麩作為飼料預(yù)培養(yǎng)3天后進(jìn)行飼蟲試驗。按照1.5的誘導(dǎo)方法，將誘導(dǎo)后的pET28a-EuCPI/BL21和pET28a/BL21菌液稀釋到OD600=0.8分裝后備用。分別用pET28a-EuCPI/BL21和pET28a/BL21兩種菌液麥麩混合飼料(1 g麥麩加1 mL菌液)飼喂試蟲，另取干麥麩飼喂試蟲作為對照組(CK)，每種處理3次重復(fù)，每次重復(fù)30頭生長狀況相似的試蟲，每天定時更換飼料并稱重。根據(jù)單頭試蟲平均體質(zhì)量變化用GraphPad Prism 8繪制生長曲線，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EuCPI基因cDNA全長系列擴(kuò)增

EuCPI基因中間區(qū)域(圖1A)，測序結(jié)果為165 bp； 擴(kuò)增得到3′-RACE產(chǎn)物(圖1B)，測序結(jié)果為378 bp，該序列含有1個Poly A尾； 5′-RACE擴(kuò)增條帶(圖1C)，測序結(jié)果為318 bp； 拼接后獲得547 bp的全長序列(GenBank登錄號： MT702592)，擴(kuò)增得到309 bp的ORF(圖1D)。生物信息學(xué)分析該基因可編碼 102 個氨基酸，且具有CPI保守結(jié)構(gòu)域(圖 2)。

圖2 EuCPI核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 杜仲EuCPI蛋白與其他植物CPI蛋白的多序列比對(A)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(B)

2.2 EuCPI基因生物信息學(xué)分析

利用相關(guān)分析軟件分析結(jié)果表明： EuCPI蛋白由102個氨基酸組成，分子質(zhì)量為11.17 kDa，分子式為C479H786N138O149S3，由1 573個原子構(gòu)成； 理論等電點(pI)為6.41，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為14，帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為13； 不穩(wěn)定指數(shù)為27.73，屬于穩(wěn)定蛋白； 脂肪族指數(shù)為80.29，總平均親水性為-0.416，屬于親水蛋白，與ProtScale預(yù)測結(jié)果一致。EuCPI基因所編碼的蛋白質(zhì)不存在跨膜域，屬于非跨膜蛋白； 該蛋白無信號肽，屬于非分泌蛋白， 主要由50%的α-螺旋、36.27%的無規(guī)則卷曲、11.76%的延伸鏈和1.96%的β-折疊組成； 使用NCBI的Conserved Domains Database進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，該蛋白屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑； 對EuCPI蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，找到了與其最相似的蛋白為芝麻(Sesamumindicum)半胱氨酸蛋白酶抑制劑蛋白(模板： 2mzv.1.A)，相似度為70.21%。

通過對12種不同植物CPI蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示這些植物氨基酸序列高度保守，均含有QXVXG和PW結(jié)構(gòu)(圖3A)； 在序列比對的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步了解EuCPI蛋白與其他植物CPI蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，用不同植物的CPI蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3B)，結(jié)果顯示，杜仲EuCPI與歐洲栓皮櫟(Quercussuber)CPI在同一分支上，說明二者親緣關(guān)系最近，并且杜仲EuCPI與芝麻和玉米(Zeamays)CPI親緣關(guān)系較近。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

構(gòu)建pET28a-EuCPI原核表達(dá)載體，該載體產(chǎn)生的蛋白為N端融合重組蛋白，具有一個6×His標(biāo)簽便于純化。通過親和層析法得到純化的目的蛋白產(chǎn)物(圖4A)； 通過Western Blot試驗得到1個15 kDa左右的條帶(圖4B)，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖4 EuCPI蛋白的純化及Western Blot結(jié)果

2.4 鹽脅迫試驗

LB固體培養(yǎng)基鹽脅迫試驗結(jié)果顯示： 當(dāng)NaCl濃度為0 mol·L-1時，pET28a-EuCPI/BL21和pET28a/BL21的單菌落生長狀況相似； 但隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度升高，pET28a-EuCPI/BL21的菌落生長數(shù)量明顯多于pET28a/BL21，尤其在NaCl濃度提高至0.75 mol·L-1時，前者正常生長但后者未長出單菌落(圖5)。

圖5 不同NaCl濃度條件下的BL21(DE3)大腸桿菌菌落生長情況

LB液體培養(yǎng)基鹽脅迫試驗結(jié)果顯示： 當(dāng)NaCl濃度為0 mol·L-1，pET28a-EuCPI/BL21和pET28a/BL21菌液生長曲線基本一致； 當(dāng)NaCl濃度升至0.25 mol·L-1時，pET28a-EuCPI/BL21和 pET28a/BL21兩種菌液均受到不同程度抑制，但前者的生長狀況明顯優(yōu)于后者(圖6A、B)。綜合這2次試驗可以推論：EuCPI基因可以提高大腸桿菌的耐鹽性。

2.5 高溫脅迫試驗

在 37、42、50 ℃ 3種溫度條件下，測定pET28a-EuCPI/BL21和pET28a/BL21菌液的生長曲線，結(jié)果顯示： 37 ℃條件下，二者生長曲線基本一致； 當(dāng)溫度升至42 ℃和50 ℃時，隨著溫度的上升，pET28a-EuCPI/BL21和pET28a/BL21菌液均產(chǎn)生了越來越明顯的生長抑制現(xiàn)象，但相同高溫脅迫條件下前者生長狀況明顯優(yōu)于后者(圖6A、C、D)，說明EuCPI基因可以提高大腸桿菌的耐高溫性。

圖6 不同脅迫條件下大腸桿菌pET28a-EuCPI/BL21生長曲線

2.6 EuCPI菌液飼蟲試驗

每天記錄試蟲的單頭平均體質(zhì)量，繪制體質(zhì)量變化曲線(圖7)?？梢钥闯鰌ET28a-EuCPI/BL21組試蟲的平均體質(zhì)量緩慢下降，而pET28a/BL21組試蟲的平均體質(zhì)量逐漸增加，用干麥麩作為飼料的對照組試蟲體質(zhì)量增長最快。SPSS分析結(jié)果顯示，三者之間差異極顯著(P<0.01)，說明EuCPI基因編碼的蛋白對黃粉蟲的生長發(fā)育有顯著抑制作用。

圖7 大腸桿菌pET28a-EuCPI/BL21飼喂黃粉蟲體質(zhì)量變化曲線

3 討論

蛋白酶抑制劑是一種多肽物質(zhì)，廣泛存在于植物中，能夠抑制蛋白水解酶的活性，在植物對生物和非生物脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。作為植物自然防御體系非常重要的組成部分，蛋白酶抑制劑通過對具有消化作用的蛋白水解酶的抑制來控制害蟲的生長、存活、繁殖，這一作用使得蛋白酶抑制劑基因成為植物基因工程中提高宿主植物抗蟲能力的潛在基因(劉會香， 2006； 李盛楠， 2010)。由于蛋白酶抑制劑具有對人無副作用、抗蟲譜廣、不易使害蟲產(chǎn)生耐受性、無化學(xué)污染等優(yōu)點(王朝霞等， 2006)，在病蟲害生物防治領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑作為蛋白酶抑制劑中的重要成員，目前已從多種植物中克隆獲得，如草本植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Belenghietal.， 2003)、水稻(Oryzasativa)(Wangetal.， 2015)、棉花(Gossypium)(潘正等， 2010)、大豆(Glycinemax)(謝翎等， 2014)、煙草(Nicotianatabacum)(林世鋒等， 2014)和木本植物荔枝(Litchichinensis)(劉興地等， 2012)、毛白楊(Populustomentosa)(張星耀等， 2007)、河北楊(Populus×hopeiensis)(劉會香， 2006)等。相關(guān)工作主要圍繞半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因在相關(guān)酶的抑制活性，在應(yīng)急反應(yīng)、防御反應(yīng)等中的作用進(jìn)行研究。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歐洲栗(Castaneasativa)幼苗受到冷、鹽和高溫脅迫時，根的半胱氨酸蛋白酶抑制劑CsC基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高(Mnicaetal.， 2000)； 麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因JcCPI能夠明顯提高大腸桿菌對鹽脅迫的耐受性，JcCPI被轉(zhuǎn)移到煙草中，與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下能更好地生長，丙二醛含量低，抗氧化酶活性和細(xì)胞活力更高(Lietal.， 2015)。本研究大腸桿菌抗性試驗結(jié)果表明，含有EuCPI基因的大腸桿菌表現(xiàn)為對鹽脅迫和高溫脅迫具有耐受性，與已報道的有關(guān)半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因在非生物脅迫方面的研究結(jié)果一致。在有關(guān)半胱氨酸蛋白酶抑制劑抗蟲功能的相關(guān)研究中，劉會香(2006)發(fā)現(xiàn)河北楊半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因?qū)λ赡炫?Monochamusalternatus)生長發(fā)育有明顯抑制作用，隨著重組蛋白濃度提高，殺蟲效果越來越明顯。葉兼菱等(2011)從雙齒圍沙蠶(Perinereisaibuhitensis)cDNA文庫中篩選出半胱氨酸蛋白酶抑制劑的編碼基因，將該編碼基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌并實現(xiàn)胞外表達(dá)，用工程菌飼喂桑天牛(Aprionagermari)結(jié)果表明對桑天牛成蟲和幼蟲較對照具有顯著致死作用。本研究中飼蟲試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn) pET28a-EuCPI/BL21組的試蟲相較于其他組，表現(xiàn)為每天的進(jìn)食量較少，蟲體表皮顏色較暗，稱量時試蟲活動能力較差，體質(zhì)量有下降趨勢，這種對試蟲明顯的抑制現(xiàn)象與前人有關(guān)半胱氨酸蛋白酶抑制劑作用于鞘翅目昆蟲的研究結(jié)果是一致的。

EuCPI基因的克隆及功能鑒定進(jìn)一步驗證了EuCPI基因作為林木抗逆基因的可行性。此外，試驗中所采用的原核表達(dá)系統(tǒng)有其獨特的優(yōu)勢，如操作簡便、周期短、易于分離純化等，可以利用這種優(yōu)勢結(jié)合EuCPI基因耐鹽耐高溫的功能特點，開發(fā)用于生物防治和提高植物抗逆能力的特效菌液。有關(guān)EuCPI基因在真核表達(dá)系統(tǒng)基礎(chǔ)上的功能需要進(jìn)一步驗證，這將有利于深入探究轉(zhuǎn)EuCPI基因林木在逆境中的生長情況，深入了解該基因的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

從杜仲種仁中成功克隆半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因EuCPI，通過構(gòu)建原核表達(dá)載體對EuCPI基因進(jìn)行功能驗證，結(jié)果表明EuCPI基因的表達(dá)能夠提高大腸桿菌抵抗鹽脅迫和高溫脅迫的能力； 菌液飼蟲試驗表明，含有EuCPI基因表達(dá)產(chǎn)物的菌液能夠顯著抑制黃粉蟲的生長。EuCPI基因豐富了林木來源的CPI基因庫，其耐高溫、耐鹽和抗蟲的特點為林木抗性基因工程研究提供了新的資源。