舞毒蛾取食誘導小黑楊苯丙烷代謝酶活性及其相關基因的表達*

周心怡 閆麗瓊 呂云彤 孫麗麗 朱靖聞 曹傳旺

東北林業(yè)大學森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經營教育部重點實驗室 哈爾濱 150040)

植物和昆蟲在地球上共存已有數(shù)億年，在長期的進化過程中，雙方形成了一系列相互防御的策略(陳澄宇等， 2015)。蟲害誘導的植物防御反應及其復雜，不同植物、不同刺激方式和強度下的防御反應機制不同(張斌等， 2016)。1980年，Bell等(1980)提出了“植物次生代謝”概念，植物次生代謝產物是指植物中一大類對于細胞生命活動或植物生長發(fā)育正常進行并非必需的小分子有機化合物，其在植物體內含量不等，且均有自己獨特的代謝途徑，通常由初生代謝派生而來(Dixon， 2001)。參與植物防御反應的次生代謝產物主要有酚類、萜類和生物堿類，其對植食性昆蟲具有引誘、驅避、毒殺、拒食和不育等作用(王景順等， 2015)，苯丙氨酸是許多植物化合物的前體，對植物繁殖、生長、發(fā)育和防御不同類型的脅迫至關重要，苯丙氨酸代謝途徑是植物體內最重要的次生代謝途徑之一(陳曉亞等， 1996)，能夠將碳源大量轉移到苯丙氨酸衍生化合物的生物合成中，特別是木質素(Pascualetal., 2016)。在高等植物中，肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)和4-香豆酸CoA連接酶(4CL)參與苯丙烷新陳代謝過程中的核心反應(Mizutanietal., 1993)。C4H行使功能需氧且依賴NADPH，催化苯丙氨酸途徑的第二步反應，同時也是該途徑的第一個氧化反應，在肉桂酸的對位點上催化位置特異性的羥化反應，將反式肉桂酸催化生成對-香豆酸(李莉等， 2007)。目前，在水稻(Oryzasativa)、杜仲(Eucommiaulmoides)和青稞(Hordeumvulgare)等植物中已經克隆鑒定出C4H，并對其表達特性表達了分析(羅小嬌等， 2014； 李鐵柱等， 2014； 劉亞洲等， 2019)。4CL作用于苯丙氨酸代謝途徑中最后一步反應，催化各種羥基肉桂酸生成相應的硫酯，這些硫酯處于苯丙酸代謝途徑和各種末端產物特異合成途徑的分支點。4CL主要以香豆酸、咖啡酸和阿魏酸為催化底物，通常以基因家族形式存在(李莉等， 2007)，進而調控木質素、類黃酮等次生代謝物質的形成(饒國棟等， 2012)。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)的11個4CL重組蛋白中，4個在體外存在催化活性，具有較廣的底物特異性(Costaetal., 2005)；水稻中在功能上存在分化的5個4CL基因(Guietal., 2011)；毛果楊×美洲黑楊(Populustrichocarpa×P.deltoides)雜交楊僅有2個4CL基因，且同源性很高，但功能各異(Allinaetal., 1998)。然而，植物苯丙氨酸代謝途徑調控次生物質響應病蟲害脅迫的基因功能亟待進一步研究。

舞毒蛾(Lymantriadispar)屬鱗翅目(Lepidoptera)毒蛾科(Liparidae)毒蛾屬(Lymantria)，是一種世界性森林食葉害蟲，其分布廣、食性雜，可取食500多種寄主植物，給農林業(yè)生產造成了巨大損失(Lazarevicetal., 1998)。在食葉害蟲與寄主植物的互作中，寄主植物的次生代謝產物起著關鍵的“化學防御”作用，次生代謝產物大多是非揮發(fā)性物質，影響昆蟲對食物的選擇、利用和消化進程，延緩發(fā)育。據(jù)報道，分月扇舟蛾(Closteraanastomosis)取食蟲害處理的美洲黑楊后，幼蟲各發(fā)育歷期延長，對食物的利用率下降，死亡率升高(周艷瓊等， 2010)；多種信號途徑參與昆蟲取食誘導的植物防御反應，其相互作用為協(xié)同或拮抗(秦秋菊等， 2005)。小黑楊(Populussimonii×P.nigra)是從小葉楊(P.simonii)與歐洲黑楊(P.nigra)雜交組合中選出的優(yōu)良單株，具有生長速度快、抗寒、抗旱、抗病蟲害等優(yōu)良特性(沈清越等， 1979)。本研究基于小黑楊轉錄組文庫中獲得的C4H和4CL基因序列，測定舞毒蛾取食和機械損傷脅迫下苯丙氨酸代謝途徑中關鍵基因C4H、4CL的表達量以及酶活性變化情況，從轉錄和蛋白水平上揭示小黑楊誘導抗性的形成和發(fā)展規(guī)律，以期為明確楊樹抗蟲性分子機制提供理論依據(jù)，并為利用基因工程手段提高寄主抗蟲性提供基因材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

舞毒蛾卵塊和人工飼料購自中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所。將舞毒蛾卵塊包裹于紗布中，使用體積分數(shù)為10%為甲醛溶液浸泡1 h，用蒸餾水漂洗，打開紗布，晾干卵塊表面水分后將卵塊放入塑料培養(yǎng)盒(直徑9 cm)，置于溫度(25 ±1)℃、光照14L∶10D、相對濕度75%的人工培養(yǎng)箱內，并及時將新孵出的舞毒蛾幼蟲轉入盛有人工飼料的培養(yǎng)盒中。選取健康、大小一致的4齡幼蟲進行試驗。

小黑楊植株由東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室提供。參照劉桂豐等(2002)方法，待組培幼苗在培養(yǎng)瓶中長出完整根系后，打開瓶蓋，置于塑料大棚煉苗3～4天。從瓶中取出幼苗，小心洗去附著在根部的培養(yǎng)基，種植于經過除菌劑代森鋅(80%可濕性粉劑，沈陽農藥有限公司生產，質量濃度4 g·L-1)處理3天后的草炭土與沙子等量混合的基質中，置于相對濕度60%～70%的塑料大棚遮蔭培養(yǎng)(姜靜等， 2004)。選用平均直徑18.31 mm±2.15 mm、平均株高110.27 cm±3.79 cm的植株進行脅迫處理。

1.2 C4H和4CL基因克隆與分析

采用CTAB法提取健康小黑楊的總RNA(曾凡鎖等， 2007)，用于構建轉錄組文庫，采用IIlumina HiSeqTM2000進行測序(深圳華大基因科技有限公司)。C4H和4CL基因克隆與分析參考劉鵬等(2017)方法，首先利用NCBI中Blastx和Blastn分析轉錄組文庫中的Unigenes 功能，根據(jù)注釋結果，查找并獲得C4H和4CL基因序列，然后設計特異性引物進行RT-PCR驗證，通過測序獲得C4H和4CL基因全長序列。開放閱讀框采用ORF Founder (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)程序確定，蛋白質分子質量和理論等電點用ProtParam (http:∥au.expasy.org/tools/protparam.html) 軟件計算推導，利用SignlP4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析氨基酸序列中信號肽，運用NCBI的Conserved Domains程序(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測蛋白保守區(qū)，通過Blast (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行序列同源性搜索，選擇與其相似程度高的不同植物C4H和4CL氨基酸序列，用ClustalW進行多序列比對。應用Clustalx (1.83)和MEGA5.1，采用鄰接法(neighbor-joining, N-J)構建系統(tǒng)發(fā)育樹(Brodskyetal., 1993)。

1.3 舞毒蛾取食和機械損傷處理

試驗于2018年7月下旬進行。選用株高一致、無病蟲害的健康小黑楊植株，隨機選擇健康、大小一致的舞毒蛾4齡幼蟲(不區(qū)分雌雄)。設計舞毒蛾取食處理(采用每株放置30頭舞毒蛾幼蟲，使其在植株上均勻分布)、機械損傷處理(高壓蒸汽滅菌剪刀仿照舞毒蛾取食造成的損傷形狀對小黑楊葉片進行機械損傷處理)和對照(未進行任何損傷)3種處理， 處理期間所有植株均用100網目尼龍紗網套籠，以防止其他昆蟲取食和舞毒蛾幼蟲逃逸。根據(jù)舞毒蛾幼蟲取食小黑楊情況，處理24 h后，剪取全株葉片作為測試樣本，并迅速放入液氮中，帶回置于-80 ℃冰箱內備用。

1.4 C4H和4CL活性測定

C4H活性按照試劑盒說明書(北京雷根公司)測定。從冰箱中取0.5 g待測樣品，加入2 mL C4H Lysis Buffer，冰浴下玻璃勻漿器充分勻漿，4 ℃下 10 000 r·min-1離心15～20 min，取上清液，-20 ℃凍存，用于C4H活性測定。測定管中加入1.64 mL蒸餾水、0.05 mL酶液、0.25 mL C4H Lysis Buffer、NADPH工作液(取試劑盒中1支NADPH加入1 mL蒸餾水充分溶解，即為NADPH工作液)和0.05 mL C4H Assay Buffer，對照管中不加入C4H Lysis Buffer，其他成分均與測定管相同。以對照管調零，立即用分光光度計(比色杯光徑為1 cm)測定OD 290 nm處吸光度。37 ℃準確孵育1 h，立即用分光光度計測定OD 290 nm處吸光度。以每分鐘每毫克蛋白變化0.01OD為1個酶活性單位(U)。

4CL活性參照Knobloch等(1977)方法測定。準確稱取1 g待測樣品，加入預冷提取液(含50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.9，15 mmol·L-1β-巰基乙醇，5 mmol·L-1EDTA，5 mmol·L-1Vc，10 mmol·L-1leupeptin，1 mmol·L-1PMSF，0.15% PVP，30%甘油)，冰浴下玻璃勻漿器充分勻漿，4 ℃下 4 000 r·min-1離心15 min，取上清液作為4CL粗酶液。測定管反應體系為0.45 mL 15 μmol·mL-1Mg2+、0.15 mL 5 μmol·mL-1香豆酸、0.15 mL 50 μmol·mL-1ATP、0.15 mL 1 μmol·mL-1CoA和0.5 mL酶液，對照管同等條件下以0.15 mL ddH2O替代香豆酸。于40 ℃下反應10 min，波長333 nm處測定吸光度，以每分鐘每毫克蛋白變化0.000 1OD為1個酶活性單位(U)。蛋白質含量測定參照Bradford(1976)的考馬斯亮藍G-250法。

1.5 實時熒光定量RT-PCR

隨機挑選舞毒蛾取食組、機械損傷組和對照組的小黑楊葉片，采取CTAB法提取總RNA(曾凡鎖等， 2007)，用DNase Ⅰ(Promega)消化總RNA中的DNA，測定質量濃度，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)合成cDNA，將cDNA稀釋10倍，作為模板備用，使用試劑盒TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen)進行實時熒光定量RT-PCR。內參基因(EF1β和UBQ)、C4H-1、C4H-2和4CL基因引物序列見表1。實時熒光定量RT-PCR反應體系為10 μL 2 ×TransStart Tip Green qPCR SuperMix酶、正向和反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL、2 μL稀釋的cDNA，加去離子水補足20 μL； 反應條件為94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，81 ℃讀板1 s，45個循環(huán)，每處理重復3次，采用2-ΔΔCt方法進行基因相對表達量分析(呂云彤， 2020； Pfaffletal., 2002)。

表1 實時熒光定量RT-PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 小黑楊C4H和4CL基因特性分析

從小黑楊轉錄組文庫中克隆鑒定獲得小黑楊C4H-1、C4H-2和4CL基因，全長基因開放閱讀框大小為1 518～1 740 bp，編碼505～579個氨基酸，蛋白分子質量為58.00～63.03 kDa，理論等電點pI為5.63～9.09，C4H-1和C4H-2為堿性蛋白，4CL為酸性蛋白(表2)。Blastp對3個基因保守區(qū)的預測結果表明，C4H-1和C4H-2蛋白屬于p450家族基因蛋白，4CL屬于多結構域蛋白超家族(AFD-class-Ⅰ)。

表2 小黑楊C4H和4CL基因特性

通過Blastp進行序列同源性搜索，選擇與小黑楊C4H-1、C4H-2同源的35種植物的C4H蛋白以及與小黑楊4CL同源的27種植物的4CL蛋白進行多序列比對，分別構建C4H和4CL系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)進化樹分析表明，小黑楊C4H-1與銀白楊(P.alba)TKR74890.1同源性為98.87%，親緣關系近聚為一類， C4H-2與毛白楊(P.tomentosa)APR63996.1、歐洲山楊(P.tremuloides)ABF69 102.1、毛果楊×美洲黑楊AAG50231.1和毛果楊XP002319974.1具有較高同源性聚為一類(圖1)；小黑楊4CL與毛果楊×美洲黑楊AAK58909.1和毛果楊XP002325815.1親緣關系較近(圖2)。

圖1 小黑楊C4H蛋白與35種植物C4H蛋白的系統(tǒng)進化樹

圖2 小黑楊4CL蛋白與27種植物4CL蛋白的系統(tǒng)進化樹

2.2 舞毒蛾取食和機械損傷對小黑楊C4H和4CL基因表達量的影響

如圖3所示， 舞毒蛾取食誘導小黑楊C4H-1、C4H-2和4CL基因表達量增加； 機械損傷誘導小黑楊C4H-1基因表達上調，而對C4H-2和4CL基因表達下調。舞毒蛾取食24 h后，小黑楊C4H-1、C4H-2和4CL基因相對表達量分別為對照組的6.86、1.15和1.50倍； 機械損傷24 h后，小黑楊C4H-1、C4H-2和4CL基因相對表達量分別為對照的1.80、0.71和0.60倍。

圖3 舞毒蛾取食和機械損傷對小黑楊C4H和4CL

2.3 舞毒蛾取食和機械損傷對小黑楊C4H和4CL活性的影響

如圖4所示，舞毒蛾取食C4H活性為748.60 U·mg-1，是對照的16.69倍； 4CL活性為2 610.36 U·mg-1，是對照的17.05倍。機械損傷C4H活性為219.19 U·mg-1，是對照的4.89倍； 4CL活性為1 196.93 U·mg-1，是對照的7.82倍。雖然舞毒蛾取食和機械損傷均能誘導小黑楊C4H和4CL活性，但取食的誘導作用顯著高于機械損傷，分別為機械損傷的3.42和2.18倍。

圖4 舞毒蛾取食和機械損傷對小黑楊C4H和4CL活性的影響

3 討論

植物在進化過程中對昆蟲和病原菌危害以及植食性動物取食形成了多種防御機制，一般可分為組成型防御機制和誘導型防御機制，其中誘導防御機制是植物防御侵害過程中的主要機制(Waretal., 2012)。植物防御外界侵害時通常會產生包括蛋白酶抑制劑、氧化酶系、苯丙烷類代謝途徑酶、糖結合蛋白和病程相關蛋白等一系列防御蛋白(秦秋菊等， 2005)，植物苯丙氨酸生物合成代謝途徑在逆境脅迫條件下，相關酶基因的轉錄水平會發(fā)生一系列改變，以誘導相應化合物的合成與積累(Fahrendorfetal., 1993； 陳鴻翰等， 2013)。Chaman等(2013)研究發(fā)現(xiàn)蚜蟲侵染大麥(Hordeumvulgare)后會引起苯丙氨酸酶(phenyalanine ammonia-lyase,PAL)活性升高，且在具有抗蚜蟲作用的大麥中PAL活性高于敏感品種。Cao等(2011)研究表明，小黑楊被舞毒蛾取食和機械損傷后PAL活性和mRNA表達水平增加。木質素是植物防御害蟲取食的重要物質，C4H和4CL是木質素生物合成途徑中的關鍵酶，通過調控C4H和4CL基因表達量可以影響木質素的合成量(李偉等， 2003)；同時，木質素與細胞木質化以及植物損傷部位傷口愈合密切相關，能夠間接參與植物對植食性害蟲的防御作用(蘇晶等， 2014)。馬尾松(Pinusmassoniana)受到害蟲取食后，產生的木質素對植食性害蟲具有毒殺作用(任琴等， 2007)。

苯丙氨酸在PAL作用下形成反式肉桂酸，經C4H和4CL催化的一系列反應后成木質素單體，最后木質素單體聚合形成木質素。木質素作為植物防御外界侵害的物理屏障，充實細胞壁的同時也增強了細胞壁抗真菌穿透和抗酶溶解的能力(郭艷玲等， 2012)。本研究表明,小黑楊C4H-1和C4H-2屬于p450家族基因蛋白，4CL屬于多結構域蛋白超家族(AFD-class-Ⅰ)。舞毒蛾取食對小黑楊C4H-1、C4H-2和4CL基因表達量的影響主要表現(xiàn)為誘導上調，機械損傷對小黑楊C4H-1基因表現(xiàn)為誘導上調，而對C4H-2和4CL基因主要表現(xiàn)為抑制其表達下調。此外，舞毒蛾取食和機械損傷均能誘導C4H和4CL活性增加且舞毒蛾取食的活性變化顯著高于機械損傷，這表明小黑楊機體可能通過增加木質素合成途徑中C4H和4CL的活性以提高木質素含量來抵御損傷逆境脅迫。已有研究表明，木質素盡管是組成型的結構物質，但具有相當強的受誘導合成特性(Buchananetal., 2015)。

小黑楊對舞毒蛾取食和機械損傷處理表現(xiàn)出不同的應激反應，這可能是由于舞毒蛾唾液中存在的效應因子在調控植物防御反應中發(fā)揮重要作用，而機械損傷僅僅是一個物理因素。研究發(fā)現(xiàn)，在昆蟲與植物的互作過程中，植食性昆蟲的唾液起重要作用。植物識別不同種昆蟲唾液中的特異性激發(fā)子從而對其防御反應進行精準調控(禹海鑫等， 2015)。甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)口腔內的分泌物N-(17-羥基亞麻酸基)-L-谷氨酸可誘導植物釋放揮發(fā)性信號物質，其中包括可以吸引天敵的誘導素，但機械損傷單獨誘導不能產生此類誘導素(Albometal.， 1997)。進一步研究，昆蟲的唾液還能降解植物防御次生代謝物質，如水稻褐飛虱(Nilaparvatalugens)唾液腺中的一種纖維素酶內切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，NIEG1)，能夠幫助褐飛虱適應水稻細胞壁的物理屏障，同時可以水解細胞壁中的纖維素，提高其在水稻韌皮部的取食效率(Jietal., 2017)；巢菜修尾蚜(Megouraviciae)利用口器刺穿蠶豆(Viciafaba)韌皮部時，會分泌唾液封閉植物篩管細胞所形成的傷口，導致Ca2+在篩管細胞內外無法產生濃度差，進而阻斷Ca2+信號傳遞途徑，抑制植物防御反應(Willetal.， 2007)。在一定程度上，誘導抗性強弱與誘導因子類型相關，且在大多數(shù)情況下為正相關，誘導因子強度越高，誘導抗性表現(xiàn)越明顯(張斌等， 2016)。因此，本研究舞毒蛾取食處理小黑楊體內的C4H和4CL基因表達水平高于機械損傷處理，可能是由于昆蟲取食在一定程度上抑制了植物次生代謝產物的抗逆作用，而黃酮類、萜類和多糖類等相關產物的基因被誘導增強，可產生更多的次生代謝產物。機械損傷對小黑楊的傷害是瞬時且相對簡單的，當產生的木質素達到一定程度時，相關基因表達量降低，這可能是苯丙氨酸代謝途徑下游基因4CL表達量下調的原因。小黑楊C4H-1基因表達可能是取食和機械損傷作用下C4H活性升高的主要來源，而機械損傷導致4CL活性增加可能存在其他更多4CL家族基因表達導致的。

4 結論

舞毒蛾取食和機械損傷均能誘導小黑楊C4H和4CL活性增加，且取食誘導顯著高于機械損傷； 舞毒蛾取食和機械損傷對C4H和4CL基因表達影響存在差異性。應進一步研究C4H和4CL家族基因功能及蛋白互作機制，以助于認識昆蟲與寄主植物互作機制并通過遺傳工程開發(fā)抗性植物控制害蟲。