玉露花莖誘導(dǎo)的2種愈傷組織細(xì)胞學(xué)及分化研究

張青華 王微 陳鵬 謝文申 張應(yīng)華

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院 云南昆明 650201;2 北京擎科生物科技有限公司昆明分公司 云南昆明 650051;3 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)香料中心 云南昆明 650201;4 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省滇臺(tái)特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程研究中心 云南昆明 650201)

玉露（Haworthia cooperi）為百合科十二卷屬多年生肉質(zhì)草本植物，是軟葉品種，原產(chǎn)于南非，現(xiàn)世界多地均有栽植，因其透亮如露珠的外形而深受歡迎，市場(chǎng)需求較大［1-2］。玉露傳統(tǒng)的繁殖方法主要有分株、葉插、莖插、播種［1］等。傳統(tǒng)繁殖方法存在繁殖周期長(zhǎng)、效率低的問題。近年來組織培養(yǎng)因其繁殖速度快、成苗量大而逐漸成為玉露種苗生產(chǎn)的一種重要方法?，F(xiàn)階段對(duì)玉露組織培養(yǎng)的研究主要集中在外植體的選用、快繁建立、增殖、生根階段激素的配比等方面，如外植體主要用花莖和葉片，激素主要用生長(zhǎng)素（NAA、IAA、IBA AC）和細(xì)胞分裂素（KT、6-BA）搭配［3-5］。以上相關(guān)研究促進(jìn)了玉露組培技術(shù)的發(fā)展，但是還存在諸多問題，一些品種存在快繁的瓶頸問題，如繁殖率低、玻璃化和褐化等，至今仍然沒有得到很好的解決［5］。為解決這一系列問題，了解植株再生過程中愈傷組織的分化情況很有必要。愈傷組織器官形成方式有不定芽發(fā)生和胚狀體發(fā)生兩種，離體培養(yǎng)中植株以體細(xì)胞胚的方式再生在園藝植物中較為常見［6］，植物體細(xì)胞胚再生方式具有普遍發(fā)生、遺傳穩(wěn)定、適于作為外源基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)等優(yōu)點(diǎn)［7］。目前，對(duì)玉露愈傷組織的研究較少，嚴(yán)小峰等［8］對(duì)誘導(dǎo)玉露胚性愈傷組織的激素配比進(jìn)行研究，但判定胚性愈傷組織僅憑眼睛觀察；朱潔瓊等［9］對(duì)冰燈玉露的體細(xì)胞胚形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)進(jìn)行研究，但是沒有愈傷組織分化過程的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)研究。本研究對(duì)玉露體細(xì)胞誘導(dǎo)的愈傷組織以及愈傷組織的分化做了形態(tài)學(xué)，細(xì)胞學(xué)方面的探討，以期明確玉露愈傷組織分化的途徑及不同分化途徑的區(qū)別，為優(yōu)化十二卷屬觀賞植物離體快繁技術(shù)體系以及新品種創(chuàng)造提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

玉露花莖來源于溫室栽培。

1.1.2 試劑

蒸餾水，75% 酒精，0.1% HgCl2，10% NaClO，MS 培養(yǎng)基，NAA，6-BA，蔗糖，谷氨酰胺，水解酪蛋白，碘化鉀，玻片等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)體系的建立

1.2.1.1 材料處理

于2017 年3 月中旬取溫室栽培的玉露花莖，長(zhǎng)10～20 cm，在自來水下沖洗，除去花莖表面灰塵、花粉等雜物；沖洗好后剪成合適長(zhǎng)度，用蒸餾水浸泡攪拌2 min；將處理好的花莖放入75%的酒精中消毒30 s，接著用0.1% HgCl2消毒5 min，10%NaClO 消毒4 min。以上每項(xiàng)處理之后，均用無菌水沖洗5次。

1.2.1.2 愈傷組織誘導(dǎo)

將滅菌后的每個(gè)花莖用吸水紙吸干表面水分，然后剪成1～1.5 cm 的莖段，將其接種在MS+0.2 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+3%蔗糖、pH 5.8 的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為21～23℃。

1.2.1.3 繼代培養(yǎng)

將獲得的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為MS+0.2 mg/L NAA +1.5 mg/L 6-BA+3%蔗糖+100 mg/L 谷氨酰胺+250 mg/L 水解酪蛋白。轉(zhuǎn)接愈傷組織時(shí)，去掉外植體，小心地將愈傷組織成塊轉(zhuǎn)接。培養(yǎng)溫度21～23℃，光照強(qiáng)度為2 200 lx，12 h/d，培養(yǎng)25 d 之后繼續(xù)繼代，直至愈傷組織分化。

1.2.2 玉露胚性愈傷組織細(xì)胞學(xué)的鑒定

1.2.2.1 1%碘化鉀溶液的配制

稱取8 g 碘化鉀溶于100 mL 蒸餾水中，待全部溶解后，加入1 g 的碘，振蕩，完全溶解后保存在棕色瓶?jī)?nèi)。

1.2.2.2 淀粉染色觀察

用潔凈紗布將載玻片和蓋玻片擦拭干凈，然后在載玻片中央滴一滴清水，用單面刀片切取一小塊愈傷組織，完全浸入水滴，將愈傷組織展平，蓋上蓋玻片，避免出現(xiàn)氣泡；在蓋玻片一側(cè)滴一滴1%碘化鉀溶液，用吸水紙從另一端吸引，使染液完全浸潤(rùn)標(biāo)本；靜置染色10～15 min 后用顯微鏡進(jìn)行觀察記錄，拍照。

1.2.2.3 石蠟切片制作

石蠟切片采用常規(guī)的石蠟切片方法，采用鐵礬—蘇木精染色法。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉露花莖誘導(dǎo)的愈傷組織繼代培養(yǎng)

玉露花莖外植體接種在培養(yǎng)基上10～15 d 后，上部分幼嫩位置的花莖開始膨大，初步誘導(dǎo)出緊密、淡綠色、質(zhì)地較硬的塊狀愈傷組織（圖1-a）；經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)后，愈傷組織增殖并且形態(tài)發(fā)生改變，繼續(xù)培養(yǎng)，逐漸出現(xiàn)2種不同形態(tài)的愈傷組織，一種是松脆顆粒狀愈傷組織（圖1-b），另一種是結(jié)構(gòu)較為松散，外表粗糙的愈傷組織（圖1-c）。

圖1 玉露花莖誘導(dǎo)出的愈傷組織

2.2 兩種愈傷組織外部形態(tài)鑒定結(jié)果

對(duì)2 種不同的愈傷組織進(jìn)行外部形態(tài)學(xué)觀察。觀察結(jié)果顯示：A類愈傷組織外表呈顆粒狀（圖1-b），顏色為淡黃綠色，外表光滑，質(zhì)地較硬；B 類愈傷組織外表呈團(tuán)狀（圖1-c），顏色為黃白色，外表粗糙，質(zhì)地綿軟。

2.3 兩種愈傷組織細(xì)胞觀察結(jié)果

對(duì)2種愈傷組織做細(xì)胞觀察。淀粉染色結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)，A 類愈傷組織染色的細(xì)胞較多，染色較深，單個(gè)細(xì)胞可觀察到明顯的淀粉顆粒（圖2-a）。B 類愈傷組織不能染色或僅在細(xì)胞周邊染色，難以觀察到明顯的淀粉顆粒（圖2-e）。石蠟切片觀察結(jié)果顯示，A 類愈傷組織可觀察到細(xì)胞較小、染色較深、細(xì)胞核明顯、排列整齊的細(xì)胞群（圖2-b、2-c）；有細(xì)胞核的單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞核和核仁較大，細(xì)胞質(zhì)染色明顯，說明胞質(zhì)濃厚（圖2-d）。B類愈傷組織愈傷組織細(xì)胞大小不均勻，細(xì)胞排列松散且細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞核不明顯（圖2-f、2-g）；有細(xì)胞核的單個(gè)細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)未被染色，且細(xì)胞核較小（圖2-h）。初步判斷A類愈傷組織中細(xì)胞較小、染色較深、核仁較大、胞質(zhì)濃厚的細(xì)胞群為胚性細(xì)胞。

2.4 兩種愈傷組織分化情況的細(xì)胞學(xué)觀察

將A、B兩類愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)，A類愈傷組織保持顆粒狀增殖并開始分化，B 類愈傷組織增殖為塊狀、水漬狀愈傷組織，并逐步開始分化。A類和B 類愈傷組織的分化途徑明顯不同。A 類愈傷組織分化時(shí)在愈傷組織表面出現(xiàn)綠色半透明突起（圖3-a），從中能觀察到分化出的球形胚（圖3-b）、子葉形胚（圖3-c、3-d）；切片觀察顯示，綠色半透明突起為多個(gè)分化的胚性細(xì)胞團(tuán)（圖3-e），正在分裂的胚性細(xì)胞團(tuán)周圍的細(xì)胞為非胚性細(xì)胞，說明每一個(gè)分化的胚性細(xì)胞團(tuán)相對(duì)獨(dú)立（圖2-b）；在分化的細(xì)胞團(tuán)中能觀察到胚芽和胚柄（圖3-f），說明體細(xì)胞胚分化的雙極性；觀察到分化出的芽體型較小，形態(tài)較為完整（圖3-g）；繼續(xù)培養(yǎng)，成苗速度較快，再生苗變異?。▓D3-h）。B類愈傷組織分化初期為綠色不規(guī)則突起，這些突起繼續(xù)分化形成單極器官芽，經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)后以產(chǎn)生不定芽的方式繼續(xù)分化（圖3-i）；切片能觀察到不定芽的細(xì)胞分化，與胚性細(xì)胞相比，這些細(xì)胞保持較大和較為松散的形態(tài)進(jìn)行分裂、分化（圖3-j），同時(shí)還觀察到幾個(gè)不定芽連在一起分化的情況（圖3-k）；分化出的不定芽形態(tài)不完整，大小差異大，繼續(xù)培養(yǎng)可以成苗（圖3-l）；后期培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)成苗的速度慢，變異較為明顯。

2.5 兩種愈傷組織的判斷

圖2 兩種愈傷組織細(xì)胞觀察結(jié)果

根據(jù)Zimmerman 的體細(xì)胞胚發(fā)生理論［6］，體細(xì)胞胚發(fā)生于胚性細(xì)胞，其過程不產(chǎn)生與母體組織相聯(lián)系的維管組織，與植物合子胚的發(fā)育過程類似，具有兩極性的發(fā)生形式。在甘蔗、棉花等作物的胚性愈傷組織均發(fā)現(xiàn)有松脆顆粒狀結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)比較緩慢或排列較松散且易碎的外部形態(tài)學(xué)特征，胚性細(xì)胞具有細(xì)胞較小，細(xì)胞質(zhì)的多胺、可溶性糖、淀粉含量較高，具有較大的細(xì)胞核和核仁，染色較深，呈圓形，細(xì)胞排列有序等特點(diǎn)［10-12］。胚性愈傷組織分化時(shí)，有成苗量大、速度快、芽結(jié)構(gòu)完整的特點(diǎn)［12］。根據(jù)對(duì)玉露誘導(dǎo)的兩種愈傷組織細(xì)胞的觀察結(jié)果，以及愈傷組織分化的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果，推測(cè)A類愈傷組織為體細(xì)胞誘導(dǎo)的胚性愈傷組織，這種愈傷組織的植株再生方式為體細(xì)胞胚胎發(fā)育方式，分化過程類似于合子胚的發(fā)育方式，再生植株來自于胚性愈傷組織中胚性細(xì)胞的分裂和分化。B 類愈傷組織為非胚性愈傷組織，再生植株來源于繼代培養(yǎng)后有分化能力的非胚性細(xì)胞分化的不定芽。胚性愈傷組織發(fā)生的再生植株較多，體型較小，每個(gè)芽彼此分離，眼睛可見有葉和莖部較為完整的植株器官，繼續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)較快，能有效避免玉露組織培養(yǎng)易變異的問題，并且保持較高的成苗率。非胚性愈傷組織通過不定芽的方式產(chǎn)生再生植株，植株往往最先分化出單極器官芽，分化時(shí)會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)芽連在一起分化的情況，繼續(xù)培養(yǎng)能夠成為再生植株，但生長(zhǎng)分化速度慢，芽變異較為明顯。

圖3 兩種愈傷組織的分化觀察

3 討論與結(jié)論

觀賞型植物胚性愈傷組織可通過不同的外植體誘導(dǎo)得到，如種子（多花薔薇）［13］、葉柄（百合）［14］、花絲（白姜花）［15］，下胚軸、子葉、莖段（白刺花）［16］。本研究使用玉露花莖為外植體，經(jīng)過脫分化誘導(dǎo)出胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織細(xì)胞核大、細(xì)胞質(zhì)濃密、排列緊密；非胚性愈傷組織細(xì)胞呈不規(guī)則排列，分布較松散，細(xì)胞間隙較大，為無明顯細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的細(xì)長(zhǎng)或大的高度液泡化的大型薄壁細(xì)胞團(tuán)，這與朱潔瓊等［9］以冰燈玉露葉片為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)果一致，說明玉露外植體脫分化產(chǎn)生的愈傷組織中同時(shí)存在胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，其中胚性愈傷組織發(fā)生較為普遍。在胚性愈傷組織的分化過程中，觀察到了球形胚、子葉形胚，說明胚性愈傷組織的分化是按照體細(xì)胞胚胎的發(fā)育過程進(jìn)行的，這樣可確保再生植株的遺傳穩(wěn)定性。在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用上，本研究使用NAA 和6-BA，嚴(yán)小峰等［8］使用6-BA 和2，4-D，朱潔瓊等［9］使用6-BA 和IAA，多種生長(zhǎng)素類物質(zhì)均能誘導(dǎo)玉露產(chǎn)生胚性愈傷組織。

體細(xì)胞胚胎的再生方式相對(duì)于器官發(fā)生具有再生率高、速度快、數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，是觀賞植物大規(guī)模繁殖的一種重要方式。本研究將玉露花莖誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，對(duì)繼代及分化過程中出現(xiàn)的2種愈傷組織外形和細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)一種為胚性愈傷組織，另一種為非性愈傷組織。胚性愈傷組織以體細(xì)胞胚胎發(fā)育方式進(jìn)行分化，能觀察到球形胚、子葉形胚的發(fā)育階段，符合單子葉植物合子胚發(fā)育過程；繼續(xù)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)此方式分化的無菌苗變異小、生長(zhǎng)快。非胚性愈傷組織以器官發(fā)生方式進(jìn)行分化，大部分是先形成芽，再形成完整植株，分化過程慢，易變異。雖然玉露胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織均能分化出再生植株，但通過胚狀體途徑分化可以有效地解決組培苗變異大、玻璃化、生長(zhǎng)緩慢等問題。本研究結(jié)果可優(yōu)化十二卷屬觀賞植物離體快繁技術(shù)體系，進(jìn)一步為新品種創(chuàng)造提供一定的技術(shù)支撐。