植物病原卵菌效應(yīng)蛋白RXLR和CRN研究進(jìn)展

郭澤西 曲俊杰 劉露露 尹玲

(廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 廣西南寧 530007)

從傳統(tǒng)的生物分類學(xué)來看，卵菌被認(rèn)為是一種真菌。但從遺傳和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)角度來看，卵菌在各個方面的表現(xiàn)更接近于藻類生物，如褐藻和硅藻等。盡管卵菌被界定為真菌類生物，但卵菌與真菌之間卻存在如下幾點(diǎn)的不同：（1）二者細(xì)胞壁成分不同，真菌多由幾丁質(zhì)構(gòu)成，而卵菌主要由纖維素構(gòu)成；（2）卵菌菌絲基本上不會發(fā)生分隔，多是無隔菌絲體；（3）卵菌的營養(yǎng)體是二倍體，而真菌卻是單倍體；（4）卵菌不同于普通真菌的另一點(diǎn)是其游動孢子往往帶有雙鞭毛［1］。

近年來，研究比較多的植物卵菌主要包括疫霉屬（Phytophthora）、霜霉屬（Peronospora）、腐霉屬（Pythium）、假霜霉屬（Pseudoperonos‐pora）和白銹菌屬（Albugo）。目前已經(jīng)完成大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）、馬鈴薯疫霉菌（Phytophthora infestans）、黃瓜霜霉菌（Pseu‐doperonospora cubensis）、擬南芥霜霉菌（Hya‐loperonospora arabidopsidis）、終極腐霉（Py‐thium ultimum）、十字花科白銹菌（Albugo can‐dida）、葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）等病原卵菌的全基因組測序［2-9］，這標(biāo)志著對植物病原卵菌的研究逐漸深入到基因組層面。此外，根據(jù)現(xiàn)有的植物病原卵菌的基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)分析手段，能夠更全面地闡釋不同類型的病原卵菌的致病機(jī)理，對理解病原卵菌的致病機(jī)制以及進(jìn)化歷程都有積極影響。針對病原卵菌的致病機(jī)理研究主要在效應(yīng)蛋白上。效應(yīng)蛋白是指病原卵菌在侵入植物組織后分泌出的一種能夠影響植物體生長、發(fā)育等過程的小分子蛋白質(zhì)［10］。本文對卵菌效應(yīng)蛋白的挖掘方法、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和靶標(biāo)蛋白篩選等研究熱點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)和概述。

1 卵菌效應(yīng)蛋白的分類和挖掘

根據(jù)效應(yīng)蛋白的靶標(biāo)位置，將其分成胞外蛋白和胞內(nèi)蛋白兩類。胞外蛋白，即指卵菌分泌的效應(yīng)蛋白作用于植物細(xì)胞外，通過與植物細(xì)胞間的信號蛋白或植物細(xì)胞膜上的受體結(jié)合而發(fā)揮作用，也被叫做激發(fā)子。目前研究較多的激發(fā)子有：細(xì)胞壞死誘導(dǎo)蛋白（NLPs） 和各種蛋白酶抑制子［11］。胞內(nèi)蛋白指分泌到被侵襲植物細(xì)胞內(nèi)的蛋白，這類蛋白目前研究較多的有RXLR和CRN蛋白。

效應(yīng)蛋白的傳統(tǒng)挖掘方法為圖位克隆。近年來，基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的成熟，為快速高效挖掘效應(yīng)蛋白提供了有利工具。當(dāng)科學(xué)家完成了大豆霉菌的基因組測序后，發(fā)現(xiàn)大豆霉菌的效應(yīng)蛋白致病機(jī)制非常復(fù)雜，在侵襲植物細(xì)胞的過程中往往同時涉及多達(dá)數(shù)百個功能蛋白［2］。

通過對圖位克隆方法得到的Avr3a、Avr1b 等多個效應(yīng)蛋白的序列分析發(fā)現(xiàn)，這兩類效應(yīng)蛋白的氨基末端的順序是穩(wěn)定的［12-16］。這一研究結(jié)果證明，運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法來研究效應(yīng)蛋白的科學(xué)性和合理性。研究表明，RXLR 效應(yīng)蛋白的氨基端通常有RXLR-dEER 模塊序列，在羧基端則連接有不同的結(jié)構(gòu)域。CRN 效應(yīng)蛋白的氨基酸序列則與之不同，該類效應(yīng)蛋白的氨基端往往連接有LXLFLAK 序列元件和DWL 結(jié)構(gòu)域，在羧基端同樣包括多種多樣的結(jié)構(gòu)域?；蚪M測序分析顯示，大豆疫霉約含有396 個RXLR 效應(yīng)蛋白，擬南芥霜霉菌有134 個，橡樹疫霉菌有374 個，馬鈴薯疫霉菌有563 個，葡萄霜霉菌有100 個［17］。由此可見，RXLR 效應(yīng)蛋白在卵菌中分布非常廣泛［2，4-5］。Tian等［18］的研究結(jié)果表明，黃瓜霜霉菌中除了RXLR效應(yīng)蛋白外，還存在較多的QXLR 效應(yīng)蛋白，推測QXLR 和RXLR 兩類效應(yīng)蛋白可能具有相似的生物功能。CRN 效應(yīng)蛋白在多樣性和數(shù)量上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于RXLR效應(yīng)蛋白。

2 RXLR轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究

Guo 等［19］發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性病原菌把自身產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白分泌到寄主細(xì)胞內(nèi)，主要依靠其自身的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，該過程對于研究病原菌的致病機(jī)理非常重要。鑒于該機(jī)理，研究人員逐漸找到了研究效應(yīng)蛋白致病機(jī)理的切入點(diǎn)，即效應(yīng)蛋白從卵菌中分泌后是如何轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞的。初步研究顯示，卵菌分泌出效應(yīng)蛋白后，這些效應(yīng)蛋白必須要以某種方式穿過宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮相應(yīng)的作用。該功能的實(shí)現(xiàn)往往取決于效應(yīng)蛋白上的一段特殊轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域序列，如RXLR［15，18］、LXLFLAK［11，19］和CHXC［20］。

RXLR 效應(yīng)蛋白穿過細(xì)胞膜的機(jī)理研究比較多。RXLR 效應(yīng)蛋白通常是由卵菌的吸器所分泌產(chǎn)生，其氨基端和瘧原蟲效應(yīng)蛋白有很多相似之處。Marti 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲的效應(yīng)蛋白穿越宿主細(xì)胞（紅細(xì)胞）的細(xì)胞膜主要依賴于其氨基端的Pexel基序，推測卵菌的效應(yīng)蛋白穿過細(xì)胞膜也依賴RXLR-EER 片段。Whisson 等［22］通過實(shí)驗(yàn)對此推論進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)將致病疫霉菌的無毒蛋白Avr3a的氨基端特定序列和GusA基因進(jìn)行融合，表達(dá)于特定的疫霉菌，并用該菌株對馬鈴薯進(jìn)行侵染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有菌絲周圍的葉片細(xì)胞表現(xiàn)出GUS活性。如果將該蛋白的氨基端RXLR-EER基序突變?yōu)镽XLR-AAA、AAAA-AAA 或KMIK-DDK，侵染馬鈴薯后無法表現(xiàn)GUS 活性。Kale 等［23］對該結(jié)果進(jìn)行了反復(fù)的實(shí)驗(yàn)論證，結(jié)果表明，RXLR 效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)上的結(jié)構(gòu)域通過與植物宿主細(xì)胞膜上的PI3P 結(jié)合，調(diào)節(jié)相應(yīng)的信號通路，使效應(yīng)蛋白被宿主以內(nèi)吞的方式進(jìn)入宿主。然而，該機(jī)理并未得到業(yè)內(nèi)的廣泛認(rèn)可。Gan 等［24］經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，亞麻銹菌的分泌的AvrM 和AvrL567 進(jìn)入宿主細(xì)胞并不需要PIP3 的 參 與。Yaeno 等［25以AVR3a、AVR3a4 和AVR1b 三種常見的效應(yīng)蛋白為研究對象，通過實(shí)驗(yàn)無法重現(xiàn)RXLR 的氨基端序列與PI3P 結(jié)合。他們通過該實(shí)驗(yàn)卻意外發(fā)現(xiàn)同PI3P 結(jié)合進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)并非RXLR的氨基端，而是羧基端。他們還發(fā)現(xiàn)，AVR3a蛋白通過這種與宿主細(xì)胞膜上的PI3P結(jié)合而進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程能夠提高蛋白的穩(wěn)定性。鑒于Bailey K 等［16，18］的研究結(jié)果，他們最終否認(rèn)了AVR3a羧基端與效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理有關(guān)。

從上述研究結(jié)果可知，RXLR 效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞的機(jī)理目前仍然不清楚，可能是通過多種途徑轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入。Stephan Wawra等［26］發(fā)現(xiàn)，寄生水霉菌分泌的SpHtp1 是通過與膜上的磺基酪氨酸結(jié)合來侵入寄主的。長期以來，人們認(rèn)為瘧原蟲的效應(yīng)蛋白的PEXEL/HT 基序在其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)被特異切割，在分泌前使其氨基端的序列被乙?；?，從而以特殊的機(jī)制順利進(jìn)入宿主細(xì)胞［27-28］。Bhat‐tacharjee 等［29］的研究表明，在宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，PEXEL基序會同PI3P結(jié)合并被識別。這些研究充分表明RXLR 效應(yīng)蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞機(jī)理的復(fù)雜性和多樣性，也為進(jìn)一步闡釋效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理及作用機(jī)理提供參考。

3 靶標(biāo)蛋白的篩選

3.1 RXLR效應(yīng)蛋白的靶標(biāo)

明確卵菌效應(yīng)蛋白在寄主體內(nèi)的靶標(biāo)蛋白，對于理解效應(yīng)蛋白的致病機(jī)理和參與植物免疫的蛋白組分都是非常重要的。

已經(jīng)證實(shí)效應(yīng)蛋白侵染植物進(jìn)而干擾其免疫反應(yīng)的類型是各種各樣的。大豆疫霉菌效應(yīng)因子PSR1 和寄主體內(nèi)一個RNA 解旋酶（RNA helicase）PINP1 蛋白相互作用，使小RNA 在植物體內(nèi)的積累被抑制，植物自身的防御過程被擾亂，從而促進(jìn)卵菌在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖，使植物體染?。?0］。PsAvr3c 能夠與大豆細(xì)胞核前體RNA 剪接體蛋白GmSKPP 互作，進(jìn)而負(fù)調(diào)控先天免疫［31］。PsAvh240與位于質(zhì)膜上天冬氨酸蛋白酶GmAP1相互作用，進(jìn)而抑制GmAP1的表達(dá)，從而抑制植物質(zhì)外體免疫反應(yīng)［32］。在馬鈴薯晚疫病菌中，PiAvrblb1和一個植物凝集素受體激酶LecRK-1.9 互作從而破壞植物細(xì)胞壁和質(zhì)膜的穩(wěn)定性幫助病原菌增殖［33］。PiAvr‐blb2在病原菌細(xì)胞膜表面和寄主蛋白酶C14互作并阻止其分泌［34］。Pi03192通過與可能參與免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子NTP1 和NTP2 的互作來阻止其向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移來干擾免疫反應(yīng)［35］。PiAvr3a效應(yīng)蛋白和寄主細(xì)胞內(nèi)的一個E3 泛素連接酶CMPG1 相互作用，并增加CMPG1 的穩(wěn)定性，同時這種識別能夠被R 蛋白R3a 間接識別，并激活寄主的ETI 反應(yīng)，產(chǎn)生HR和細(xì)胞壞死［36］。PiAVR2 和蛋白磷酸酶BSL1、BSL2以及BSL3 互作，負(fù)調(diào)控BSL1 和BSL3 抑制INF1 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［37］。PexRD2 和MAPKKJKs 激酶結(jié)構(gòu)域相互作用后，抑制細(xì)胞間的MAPK 的傳導(dǎo)途徑［38］。辣椒疫霉的RxLR207 會促進(jìn)擬南芥中ACD11 的結(jié)合配體BPA1、BPL1、BPL2、BPL4 降解，通過調(diào)控活性氧（ROS）的濃度發(fā)揮免疫作用［39］。在擬南芥霜霉菌中，效應(yīng)蛋白HaRXL44能夠和擬南芥體內(nèi)一個調(diào)節(jié)亞基MED19a 互作，并抑制和水楊酸有關(guān)的基因表達(dá)［40］。HaRXL106 抑制水楊酸（SA）誘導(dǎo)的防御基因的轉(zhuǎn)錄激活，并改變植物對光的生長反應(yīng)［41］。葡萄霜霉菌分泌的效應(yīng)蛋白PvRXLR54 與葡萄葉綠素蛋白VvCBP151 直接互作，通過影響該葉綠素蛋白的光能吸收與轉(zhuǎn)化來抑制其先天免疫［42］。葡萄霜霉菌效應(yīng)蛋白PvRxL13 與葡萄的轉(zhuǎn)錄因子HY5互作從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性［43］。葡萄霜霉菌效應(yīng)蛋白PvRxLR16 通過其W/Y/L 結(jié)構(gòu)域與3 個預(yù)測糖基化位點(diǎn)來識別到葡萄中靶標(biāo)蛋白為VaCUE［44］。

3.2 CRN效應(yīng)蛋白的靶標(biāo)

目前只有很少量的CRN 效應(yīng)蛋白的靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)。大豆疫霉菌分泌的PsCRN63 和PsCRN115 共同作用于宿主細(xì)胞的CAT1，使得宿主細(xì)胞內(nèi)的PCD和過氧化氫維持在一個相對平衡的狀態(tài)，從而干擾宿主細(xì)胞的免疫過程［45］。宋天巧等［46］發(fā)現(xiàn)，PsCRN108 能夠調(diào)控宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程，該效應(yīng)蛋白通過與宿主細(xì)胞的基因HSP90上的啟動子位點(diǎn)特異結(jié)合，使宿主體內(nèi)無法正常表達(dá)防御蛋白，從而使宿主“順利”染病，這說明CRN效應(yīng)蛋白能夠?qū)χ参锛?xì)胞內(nèi)的正常功能進(jìn)行干擾。

4 展望

植物病原卵菌效應(yīng)蛋白的致病機(jī)制一直是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。植物與病原卵菌在長期的侵染與免疫中，共同進(jìn)化。病原卵菌分泌出的效應(yīng)蛋白破壞寄主的免疫反應(yīng)，寄主分泌相應(yīng)的抗病蛋白來識別效應(yīng)蛋白。目前，全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析等技術(shù)的應(yīng)用使得更多病原卵菌的效應(yīng)蛋白被挖掘。這有利于闡明不同病原菌之間的致病性差異，為探索病原菌的致病機(jī)制和進(jìn)化過程提供豐富的資源。然而，和真菌以及細(xì)菌相比，對卵菌的效應(yīng)蛋白的靶標(biāo)蛋白的了解比較少。病原卵菌的效應(yīng)蛋白數(shù)量眾多，多數(shù)的效應(yīng)蛋白與寄主之間的互作方式和效應(yīng)蛋白之間的互作以及進(jìn)入寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制都尚未清楚。因此，還需做大量的研究來解析效應(yīng)蛋白的致病機(jī)理和侵染過程等，為植物—病原物互作的分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)和參考。