PD 小鼠模型應(yīng)用硫辛酸對自噬蛋白表達(dá)水平的影響

魏濤 范小娟2

（1 徐州醫(yī)科大學(xué)公共實(shí)驗(yàn)研究中心 221000 2 江蘇省軍區(qū)徐州第三離職干部休養(yǎng)所門診部 221000）

帕金森（PD）為中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，可累及神經(jīng)、精神、運(yùn)動系統(tǒng)損傷，誘發(fā)腦部病變，嚴(yán)重危害患者身體健康[1]。目前，臨床上尚未明確PD 發(fā)病機(jī)理，但可能與線粒體功能異常、自噬作用、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等有關(guān)[2]。國內(nèi)外諸多研究證實(shí)[3-4]，線粒體自噬在保持神經(jīng)元活性、神經(jīng)細(xì)胞功能完整性方面具有重要作用。為進(jìn)一步了解硫辛酸對PD 小鼠自噬蛋白表達(dá)水平的影響，現(xiàn)對80 只健康7 周齡雄性小鼠展開研討，具體如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

儀器與材料：LSM710 型激光共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司），58404R 型高速臺式離心機(jī)（德國艾本德公司)。

免疫組化檢測試驗(yàn)盒、BCA 蛋白測定試劑盒、PINK1 抗體、DJ-1 單克隆抗體、Parkin 單克隆抗體、MPTP 分別來自于上海莼試生物技術(shù)有限公司、北京市艾德萊生物科技有限公司、巴傲得生物科技有限公司、上?？道噬锟萍加邢薰尽澜菘萍加邢薰?、四川宇康生物技術(shù)有限公司、珠海市泛海生物技術(shù)有限公司、上海仁捷生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)動物：80 只健康7 周齡雄性小鼠（徐州醫(yī)科大學(xué)動物中心）。

1.2 方法

（1）分組方法：以抓鬮法把80 只小鼠均分成四組，即PD模型組、預(yù)保護(hù)組、研究組、正常對照組。

（2）模型制作：以MPTP 背部皮下注射方式，制備PD 小鼠模型。用背部皮下注射給藥方式予以研究組、預(yù)保護(hù)組、PD模型組MPTP25mg/kg，每周2 次，連續(xù)治療5 周。造模前，用以上同樣給藥方式給予預(yù)保護(hù)組a-硫辛酸60mg/kg；造模后，予以研究組a-硫辛酸60mg/kg，持續(xù)注射2 周。正常組不給予任何處理。

（3）行為學(xué)評分：在MPTP 用藥后，查看小鼠活動狀況。藥物注射3min 內(nèi)，小鼠便出現(xiàn)全身抽搐、鼠尾與毛豎起、易激怒、抓鼻、步態(tài)蹣跚等反應(yīng)，10～20min 后恢復(fù)至正常，即可判定模型制作成功。

（4）懸掛實(shí)驗(yàn)：用金屬絲把小鼠掛到實(shí)驗(yàn)臺上，高度控制為30cm，統(tǒng)計從懸掛到落地時間，并進(jìn)行評分，其中，0～4s 即為0 分，5～9 分即為1 分，10～14s 即為2 分，15～19s 即為3 分，20～24s 即為4 分，25～29s 即為5 分，≥30s 即為6 分。

（5）爬桿實(shí)驗(yàn)：自制爬桿，將小鼠頭向上放于頂部，統(tǒng)計小鼠從一開始運(yùn)動到徹底轉(zhuǎn)變?yōu)轭^朝下運(yùn)動時間與抵達(dá)桿底的時間和。測試前，先訓(xùn)練小鼠爬桿約5 次，再次測量5次，取其平均值，每次測試間隔時間控制為1min。

（6）以Western blotting 法測定DJ-1、Parkin、PINK1、TH：在行為學(xué)判斷后開展檢測。利用0.1mg/g10%水合氯醛實(shí)施腹腔注射，以完成深度麻醉；行斷頭操作，然后，于冰上實(shí)施開顱取腦，徹底洗凈殘余血液，把黑質(zhì)紋狀體分離，并剪碎組織，將其與組織分解液充分混合，4℃下，離心，取上清液放于-80℃下保存?zhèn)溆谩５鞍锥亢?，分裝，保證蛋白濃度相同；待添加等體積上樣緩沖液后，沸煮5min。之后，添加一抗，在4℃條件下孵育1 夜；洗膜后，將二抗加入，孵育（37℃）2h，再次洗膜。利用ECL 進(jìn)行顯色，將顯影曝光，以Iamage lab 軟件對各蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析。

以免疫組化法測定小鼠DJ-1、Parkin、紋狀體PINK1、黑質(zhì)TH：待開展行為學(xué)評定后，采用10%水合氯醛實(shí)施麻醉，將心臟暴露，將靜脈留針穿入左心室，打開右心房，將生理鹽水注入左心房，用多聚甲醛進(jìn)行灌注，斷頭取腦后，固定。梯度脫水，石蠟包埋，實(shí)施連續(xù)切片。選取小鼠紋狀體、黑質(zhì)不重疊的4 倍視野4 個，在顯微鏡作用下觀測組織微觀結(jié)構(gòu)變化狀況，統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核表現(xiàn)為紫藍(lán)色或淺藍(lán)色，細(xì)胞漿表現(xiàn)為棕黃色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS24.0 處理數(shù)據(jù)，計量資料（ ）以F檢驗(yàn)，P＜0.05，即差異顯著。

2結(jié)果

2.1 4 組小鼠懸掛時間與爬桿時間對比

PD 模型組、預(yù)保護(hù)組、研究組懸掛時間均短于正常對照組，爬桿時間均長于正常對照組（P＜0.05）。PD 模型組懸掛時間均短于預(yù)保護(hù)組、研究組，爬桿時間均長于以上兩組（P＜0.05），見表1。

表1 4 組小組懸掛時間、爬桿時間對比（，s）

表1 4 組小組懸掛時間、爬桿時間對比（，s）

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2.2 4 組Western blotting 法檢測結(jié)果對比

較正常對照組，其他三組DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平下降（P＜0.05）。PD 模型組DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平均低于預(yù)保護(hù)組、研究組（P＜0.05），見表2。

2.3 4 組免疫組化法檢測結(jié)果對比

相比于正常對照組，其他三組DJ-1、Parkin、PINK1 陽性神經(jīng)元數(shù)較少（P＜0.05）。PD 模型組DJ-1、Parkin、PINK1 陽性神經(jīng)元數(shù)均少于預(yù)保護(hù)組、研究組（P＜0.05），見表3。

3 討論

近年來，跟隨著神經(jīng)元變性的深入研究，發(fā)現(xiàn)PD 治療藥物組間失去效價與有效性，故而，臨床上需改變治療方案。限制藥物應(yīng)用的重要原因?yàn)檫\(yùn)動障礙等不良反應(yīng)。硫辛酸屬生物膜成分，在動植物體內(nèi)均可見。二硫代脂肪酸為硫辛酸還原形式，其可預(yù)防及避免氧化應(yīng)激。二硫代脂肪酸與硫辛酸屬于天然抗氧化劑，為脫氧酶輔助因子，均可整合腦中金屬離子，增加維生素C、E 含量，減輕腦組織損傷，減少膜電位損傷量，提高相關(guān)酶活性，故而，就線粒體營養(yǎng)物而言，硫辛酸能起到靶向作用。在PD 常規(guī)藥物治療中，硫辛酸能有效減輕因抗PD 所引起的不良作用，進(jìn)而提升患者運(yùn)動功能與生活質(zhì)量。鑒于此，可將硫辛酸作為PD 的新型方式。

表2 4 組Western blotting 法檢測結(jié)果對比（）

表2 4 組Western blotting 法檢測結(jié)果對比（）

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PINK1 常見于Parkin 上游，在機(jī)體線粒體功能受到損傷時，其能促使Parkin 蛋白活化，誘導(dǎo)吞噬反應(yīng)。而Parkin 水平的下降，可造成線粒體斷裂，降低細(xì)胞對鈣離子的處理能力，增加對應(yīng)激易感性。除氧化作用之外，DJ-1 也可誘發(fā)自噬反應(yīng)。DJ-1 主要通過對Nurrl 的激活、上調(diào)多巴胺，改善TH 基因表達(dá)情況。DJ-1 缺失為造成自噬標(biāo)志物堆積與線粒體表型的主要原因。所以，DJ-1 蛋白功能障礙能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，從而誘發(fā)PD。研究中，四組懸掛時間、爬桿時間相比，存在明顯差異，其中，正常對照組懸掛時間最長，爬桿時間最短，PD 模型組懸掛時間最短，爬桿時間最長，這提示PD 模型制備成功，能有效保證后期實(shí)驗(yàn)開展的有效性。四組DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平相比，正常對照組均最高，PD模型組均最低，這表示硫辛酸能改善PD 小鼠DJ-1、Parkin、PINK1、TH 表達(dá)水平。四組DJ-1、Parkin、PINK1 神經(jīng)元數(shù)相比，正常對照組均最高，PD 模型組均最少，這說明硫辛酸能對PD 小鼠神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用。

表3 4 組免疫組化法檢測結(jié)果對比（，個/4 倍視野4 個）

表3 4 組免疫組化法檢測結(jié)果對比（，個/4 倍視野4 個）

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綜上，硫辛酸對PD 小鼠自噬蛋白表達(dá)水平可起到一定調(diào)節(jié)作用，有助于其病情控制。