阿法替尼增強(qiáng)耐藥性卵巢癌細(xì)胞對多柔比星化療敏感性的機(jī)制研究

余娟娟，賈瑞諾，周小燕，田曉予#

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2腫瘤內(nèi)科，河南 洛陽 471000

卵巢癌是一種婦科惡性腫瘤，其發(fā)生可能與復(fù)雜的卵巢胚胎發(fā)育、組織解剖學(xué)和內(nèi)分泌功能密切相關(guān)，卵巢癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯。化療是預(yù)防卵巢癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的方法，但腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性是化療失敗的重要原因。因此，卵巢癌化療增敏劑的篩選和開發(fā)具有重要的臨床意義。多柔比星是廣譜蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，在臨床中廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌和白血病。篩選化療增敏劑以提高多柔比星化療的療效并逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥性，是腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的異常表達(dá)與各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。阿法替尼是第一個不可逆的靶向EGFR及HER2雙受體起效的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）類藥物。但是阿法替尼聯(lián)合常用的化療藥物多柔比星對卵巢癌細(xì)胞生長的影響尚未見報(bào)道。本研究通過分析阿法替尼對卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780T體外增殖的影響，探討阿法替尼增強(qiáng)耐藥性卵巢癌細(xì)胞對多柔比星化療敏感性的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780T購自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 試劑

阿法替尼（純度＞98%）和多柔比星（純度＞98%）均購自大連美倫生物技術(shù)有限公司；RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司；雙抗體溶液購自杭州吉諾生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子B亞家族成員1（ATP binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）特異性干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成；ABCB1-GloTM Assay Systemsi試劑盒購自美國Promega公司；ABCB1抗體購自上海群己生物科技有限公司；EGFR、磷酸化EGFR（phosphorylated-EGFR，p-EGFR）、HER2、磷酸化 HER2（phosphorylated-HER2，p-HER2）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購自美國Bioworld公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10/ml，將其接種于96孔板中，每孔100 μl，即5000/孔，培養(yǎng)24 h后，棄去原始培養(yǎng)基，并向每個孔中加入不同濃度（0、0.63、1.25、2.50、5.00 μmol/L）的阿法替尼溶液。培養(yǎng)48 h后，向每個孔中添加15 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液。培養(yǎng)4 h后，小心吸出并棄去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，向每個孔中加入200 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），然后將微量滴定板置于快速振蕩器上振蕩5 min。測量每個孔的吸光度值，重復(fù)3次。計(jì)算不同濃度的阿法替尼對卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制率。根據(jù)各組的增殖抑制率，選擇對A2780T細(xì)胞增殖抑制率＜10%的阿法替尼濃度與多柔比星聯(lián)用，采用Bliss法計(jì)算半數(shù)抑制濃度。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白表達(dá)情況 采用對A2780T細(xì)胞增殖抑制率＜10%的阿法替尼濃度聯(lián)合多柔比星或單獨(dú)多柔比星處理A2780T細(xì)胞，48 h后應(yīng)用裂解液裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到離心管中高速離心，取上清液，通過BCA法測定上清液的蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度后，加入四分之一上清液體積的5×loading buffer，沸水煮5 min后獲得總蛋白樣品。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離總蛋白，每條泳道上樣20 μl，轉(zhuǎn)膜封閉，一抗孵育4℃過夜，TBST溶液洗膜10 min，共3次，孵育二抗1 h。TBST溶液洗膜10 min，共3次，采用電化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，曝光。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算EGFR、p-EGFR、HER2、p-HER2及ABCB1的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 阿法替尼對A2780T 細(xì)胞增殖的影響

不同濃度（0.63、1.25、2.50、5.00 μmol/L）阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞的增殖抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=114.584，P＜0.01）。其中，1.25、2.50、5.00 μmol/L阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞的增殖抑制率均高于0.63 μmol/L阿法替尼處理的A2780T 細(xì)胞，2.50、5.00 μmol/L 阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞的增殖抑制率均高于1.25 μmol/L阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞，5.00 μmol/L阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞的增殖抑制率高于2.50 μmol/L阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表1）

表1 不同濃度阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

2.2 不同組別A2780T 細(xì)胞半數(shù)抑制濃度的比較

選擇對A2780T細(xì)胞增殖抑制率＜10%的阿法替尼濃度與多柔比星聯(lián)用。分別將多柔比星、多柔比星+0.63 μmol/L阿法替尼、多柔比星+1.25 μmol/L阿法替尼、多柔比星+2.50 μmol/L阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞作為多柔比星組、A組、B組、C組。多柔比星組、A組、B組、C組A2780T細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=88.382，

P

＜0.01）。A組、B組、C組A2780T細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度均低于多柔比星組，B組、C組A2780T細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度均低于A組，C組A2780T細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表2）

表2 不同組別A2780T細(xì)胞半數(shù)抑制濃度的比較（±s）

2.3 不同組別A2780T 細(xì)胞中各蛋白相對表達(dá)量的比較

多柔比星組、A組、B組、C組A2780T細(xì)胞中p-EGFR、p-HER2、ABCB1蛋白的相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。A組、B組、C組A2780T細(xì)胞中p-EGFR、p-HER2、ABCB1蛋白的相對表達(dá)量均低于多柔比星組，B組、C組A2780T細(xì)胞中p-EGFR、p-HER2、ABCB1蛋白的相對表達(dá)量均低于A組，C組A2780T細(xì)胞中p-EGFR、p-HER2、ABCB1蛋白的相對表達(dá)量均低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表3）

表3 不同組別A2780T細(xì)胞中各蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的一種常見惡性腫瘤，病死率居所有婦科腫瘤中的第一位。卵巢癌患者具有非典型的早期癥狀，多數(shù)卵巢癌患者確診時(shí)已發(fā)展至晚期，5年生存率僅為25%～30%。卵巢癌易侵襲和轉(zhuǎn)移，且手術(shù)難以徹底切除病變，全身化療是臨床中卵巢癌的主要治療方法。紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物是晚期卵巢癌患者的一線化療方法。盡管大多數(shù)卵巢癌患者具有良好的初次化療效果，但是由于傳統(tǒng)的化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性，因此卵巢癌患者往往會在18個月內(nèi)復(fù)發(fā)并導(dǎo)致化療失敗，復(fù)發(fā)性化療耐藥性卵巢癌患者的平均生存期僅為1年左右。此外，化療失敗會導(dǎo)致卵巢癌發(fā)生廣泛的腹腔和盆腔轉(zhuǎn)移，使晚期卵巢癌患者的生活質(zhì)量極低。因此，尋找新的卵巢癌化療藥物具有重要的臨床意義。

EGFR和HER2的異常表達(dá)和激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。阿法替尼是第一個不可逆的TKI，其可以與EGFR的Cys773位點(diǎn)和HER2的Cys805位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合，從而不可逆地抑制這兩個關(guān)鍵受體。已有研究報(bào)道拉帕替尼和吉非替尼等第一代TKI藥物可以增強(qiáng)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性，但尚未報(bào)道不可逆TKI藥物阿法替尼的類似作用。

本研究結(jié)果顯示，阿法替尼抑制A2780T細(xì)胞增殖呈濃度依賴性，5.00 μmol/L阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞的增殖抑制率最高，選擇對A2780T細(xì)胞增殖抑制率＜10%的阿法替尼濃度與多柔比星聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)多柔比星+2.50 μmol/L阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度低于多柔比星+0.63 μmol/L 阿法替尼和多柔比星+1.25 μmol/L阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。結(jié)果表明，高濃度阿法替尼可以作為多柔比星的增敏劑用于卵巢癌的治療。分析原因是阿法替尼可通過抑制卵巢癌細(xì)胞中EGFR和HER2的磷酸化發(fā)揮抗腫瘤作用。

研究表明，阿法替尼增強(qiáng)耐藥性卵巢癌細(xì)胞對多柔比星化療的敏感性可能通過抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排功能來實(shí)現(xiàn)。位于細(xì)胞膜上的ABCB1是一種能量依賴性藥物外排泵，可以通過腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）供給能量，從而將ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體底物性化療藥物泵出細(xì)胞，使其在腫瘤中的有效濃度降低。多柔比星是ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物藥物。據(jù)報(bào)道，ABCB1在結(jié)直腸癌、胰腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌和肝癌中高表達(dá)，與惡性腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)。ABCB1對患者體內(nèi)底物藥物的吸收、分布、代謝和排泄具有重要影響。抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排活性將有助于增加具有高表達(dá)ABCB1的腫瘤細(xì)胞中ABCB1底物性化療藥物積累，從而增加化療對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。由于ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其底物分布廣泛，在聯(lián)合用藥中可能發(fā)生競爭性或非競爭性藥物相互作用，從而影響聯(lián)合用藥的藥代動力學(xué)過程。本研究結(jié)果顯示，高濃度阿法替尼聯(lián)合多柔比星處理的A2780T細(xì)胞中ABCB1蛋白相對表達(dá)量較低。研究結(jié)果證實(shí)阿法替尼可以下調(diào)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步突出了阿法替尼靶向ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的優(yōu)勢和潛力，以發(fā)揮化療增敏作用。阿法替尼是靶向EGFR和HER2雙重受體的TKI藥物，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）途徑是EGFR和HER2下游的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。多柔比星+2.50 μmol/L阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞中p-EGFR和p-HER2蛋白的相對表達(dá)量均低于多柔比星+0.63 μmol/L阿法替尼、多柔比星+1.25 μmol/L阿法替尼處理的A2780T細(xì)胞。分析原因是高濃度阿法替尼可與多柔比星發(fā)揮協(xié)同作用，有效抑制EGFR和HER2的磷酸化，激活下游PI3K/AKT途徑，發(fā)揮抗腫瘤作用。這一結(jié)果與Hirst等的研究結(jié)果一致。

目前已有研究證實(shí)阿法替尼能夠增敏鉑類藥物的化療效果，但阿法替尼聯(lián)合多柔比星的影響及其對卵巢癌是否具有增殖抑制作用目前尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，阿法替尼可通過抑制p-EGFR、p-HER2蛋白的磷酸化，競爭性抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，發(fā)揮抑制卵巢癌細(xì)胞體外增殖的作用，增敏化療藥物多柔比星對耐藥性卵巢癌細(xì)胞A2780T的效果，是一種具有潛力的卵巢癌化療增敏劑。

綜上所述，阿法替尼可增強(qiáng)耐藥性卵巢癌細(xì)胞A2780T對多柔比星的化療敏感性，可能與阿法替尼下調(diào)p-EGFR、p-HER2和ABCB1蛋白表達(dá)有關(guān)。