RNA 干擾細胞分裂周期蛋白6基因表達對結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響及其機制研究

王雁軍，王富強，王青兵，沈志玲，韓朋

安陽市腫瘤醫(yī)院1外科，2實驗室，河南 安陽 455000

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率居第3位、病死率居第2位的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，2018年全球共180多萬例結(jié)直腸癌新發(fā)病例和881 000例結(jié)直腸癌死亡病例，已經(jīng)成為全球癌癥負擔(dān)。人一生中患結(jié)直腸癌的概率為4%～5%，患病風(fēng)險與個人特征或習(xí)慣有關(guān)，如年齡、慢性病史和生活方式。腫瘤的高轉(zhuǎn)移率是結(jié)直腸癌治療的障礙，它由一系列不同的細胞過程組成，如腫瘤細胞局部侵襲周圍組織、腫瘤細胞的血管內(nèi)滲或外滲和遠處器官的定植。結(jié)直腸癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其發(fā)病機制復(fù)雜，目前主要治療方法為手術(shù)切除病灶、化療聯(lián)合放療等姑息治療。然而，這些方法都具有局限性。因此，迫切需要了解與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制，尋找生物標志物，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。細胞分裂周期蛋白6（cell division cycle 6，CDC6）是真核細胞中DNA復(fù)制的中心調(diào)節(jié)因子。研究表明，CDC6在結(jié)直腸癌中高表達，敲低CDC6的表達可抑制結(jié)直腸癌細胞生長、DNA合成、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、細胞遷移和侵襲等惡性行為以及奧沙利鉑（oxaliplatin，L-OHP）耐藥，而人抗原R（human antigen R，HuR）調(diào)控CDC6是驅(qū)動結(jié)直腸癌發(fā)生和L-OHP耐藥的重要機制。基于癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫的生存分析發(fā)現(xiàn)，CDC6低表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)，可能成為結(jié)直腸癌的預(yù)后標志物。CDC6 在宮頸癌、肺腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，提示靶向CDC6是一種很有前途的腫瘤治療策略。RNA干擾療法已顯示出治療腫瘤的巨大潛力，如結(jié)直腸癌、前列腺癌等。本研究利用RNA干擾技術(shù)分析抑制CDC6基因表達對結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，并探索其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

永生化結(jié)直腸細胞株（FHC）和結(jié)直腸癌細胞株（SW620、LOVO、HT29）均購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、RIPA裂解液、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）均購自美國Sigma公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，β肌動蛋白（β-actin）、CDC6、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、磷酸化-JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）、磷酸化-STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）均購自美國 Cell Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，si-con、si-CDC6均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶（Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin VFITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，酶標儀購自德國Eppendorf公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)FHC、SW620、LOVO、HT29細胞，其中包含10%的胎牛血清，于5% CO、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞融合至80%時，采用胰蛋白酶消化，進行接種傳代。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測CDC6、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達

采用RIPA裂解液提取FHC、SW620、LOVO、HT29細胞總蛋白，用于檢測CDC6蛋白表達；采用RIPA裂解液提取轉(zhuǎn)染si-CDC6或si-con的SW620細胞總蛋白，用于檢測 p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達。提取蛋白后，加入上樣緩沖液，進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，經(jīng)脫脂奶粉封閉，4℃條件下與相應(yīng)一抗（CDC6、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3抗體稀釋度均為1∶1000）孵育過夜，Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）漂洗 3次，每次 10 min。室溫條件下與二抗孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，置于化學(xué)發(fā)光液中顯色、顯影，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.4 RNA干擾

收集生長狀態(tài)良好的SW620細胞，以5×10/ml的密度接種于6孔板中，待細胞融合度約為75%時，嚴格按照Lipofectamine 2000試劑說明書，將si-CDC6轉(zhuǎn)染至SW620細胞（si-CDC6組），其中si-CDC6序列參考陳三三的文獻，同時以轉(zhuǎn)染si-con的SW620細胞作為陰性對照（si-con組），轉(zhuǎn)染4～6 h后，更換為含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。采用Western blot檢測si-CDC6組和si-con組SW620細胞中CDC6蛋白的相對表達量，分析轉(zhuǎn)染效果。分析轉(zhuǎn)染CDC6 siRNA對SW620細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響。此外，采用JAK2/STAT3信號通路激活劑colivelin處理轉(zhuǎn)染后的SW620細胞（si-CDC6+colivelin組），并檢測細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲情況。

1.5 MTT法檢測SW620細胞的增殖情況

調(diào)整轉(zhuǎn)染后的SW620細胞密度為5×10/ml，接種于96孔板中，在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，之后每孔加入100 μl MTT溶液（5 mg/ml），培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)液體，加入200 μl二甲基亞砜，振蕩孵育10 min充分溶解結(jié)晶，酶標儀讀取490 nm波長下各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測SW620細胞的凋亡情況

根據(jù)Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒的步驟檢測SW620細胞的凋亡情況，收集轉(zhuǎn)染后的SW620細胞1×10個，使用500 μl Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，混勻，加入5 μl PI，混勻，避光反應(yīng)15 min，采用流式細胞儀進行檢測。

1.7 Transwell 小室實驗檢測SW620細胞的侵襲和遷移情況

SW620細胞侵襲能力檢測：首先按照1∶5的比例將Matrigel膠和無血清培養(yǎng)基混勻，包被Transwell上室。收集轉(zhuǎn)染后的SW620細胞，于無血清培養(yǎng)基中調(diào)整細胞密度為5×10/ml，在上室中加入100 μl細胞，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37℃、5% CO培養(yǎng)箱中孵育24 h，采用棉簽擦除多余的SW620細胞和Matrigel膠，甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡觀察，計數(shù)。

SW620細胞遷移能力檢測：Transwell上室中不加Matrigel膠，其余步驟同SW620細胞侵襲能力檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同細胞株中CDC6蛋白相對表達量的比較

永生化結(jié)直腸細胞株FHC及結(jié)直腸癌細胞株SW620、LOVO、HT29中CDC6蛋白的相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。其中永生化結(jié)直腸細胞株FHC中CDC6蛋白的相對表達量低于結(jié)直腸癌細胞株SW620、LOVO、HT29，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.05）（圖1、表1）。選擇CDC6蛋白相對表達量最高的SW620細胞株進行后續(xù)研究。

表1 不同細胞株中CDC6蛋白相對表達量的比較（±s）

圖1 Western blot 檢測不同細胞株中CDC6蛋白的表達情況

2.2 轉(zhuǎn)染CDC6siRNA對SW620細胞增殖的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，si-CDC6組SW620細胞中CDC6蛋白的相對表達量為（0.31±0.04），低于si-con組的（1.00±0.15），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=13.334，

P

＜0.05）（圖2），說明轉(zhuǎn)染有效。MTT法檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng) 24、48、72 h后，si-CDC6組SW620細胞的OD值均明顯低于si-con組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）（表2）。

圖2 Western blot 檢測不同組別SW620細胞中CDC6蛋白的表達情況

表2 不同組別SW620細胞轉(zhuǎn)染后OD值的比較（±s）

2.3 轉(zhuǎn)染CDC6siRNA對SW620細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，si-CDC6組SW620細胞的凋亡率為（33.12±3.86）%，高于si-con組的（3.27±0.34）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=23.110，

P

＜0.05）。（圖3）

圖3 流式細胞術(shù)檢測不同組別SW620細胞的凋亡情況

2.4 轉(zhuǎn)染CDC6siRNA對SW620細胞侵襲和遷移的影響

Transwell小室實驗結(jié)果顯示，si-CDC6組的侵襲細胞數(shù)目和遷移細胞數(shù)目均明顯少于si-con組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表3）

表3 不同組別SW620細胞中侵襲和遷移細胞數(shù)目的比較（±s）

2.5 轉(zhuǎn)染CDC6siRNA對SW620細胞JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，si-CDC6組SW620細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白的相對表達量均明顯低于si-con組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）；si-CDC6組和si-con組SW620細胞中JAK2、STAT3蛋白的相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。（圖4、表4）

表4 不同組別SW620細胞中JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白相對表達量的比較（±s）

圖4 Western blot 檢測不同組別SW620細胞中JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白的表達情況

2.6 激活JAK2/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)CDC6siRNA對SW620細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響

培養(yǎng) 24、48、72 h后，si-CDC6+colivelin組SW620細胞的OD值均明顯高于si-CDC6組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）（表5）。si-CDC6+colivelin組SW620細胞的凋亡率為（7.16±0.73）%，低于si-CDC6組的（35.09±3.24）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=25.229，

P

＜0.05）（圖 5）。si-CDC6+colivelin 組的侵襲細胞數(shù)目和遷移細胞數(shù)目分別為（36.72±3.96）個和（56.41±5.67）個，分別高于si-CDC6組的（20.13±2.58）個和（29.14±3.05）個，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=10.530、12.707，

P

＜0.05）。

表5 si-CDC6組和si-CDC6+colivelin組SW620細胞轉(zhuǎn)染后OD值的比較（±s）

圖5 流式細胞術(shù)檢測si-CDC6組和si-CDC6+colivelin組SW620細胞的凋亡情況

3 討論

目前結(jié)直腸癌已成為中國第四大常見的惡性腫瘤，也是男性和女性惡性腫瘤相關(guān)死亡的第五大和第四大原因。早期檢測分子標志物是預(yù)防結(jié)直腸癌的最有效方法。然而，結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未得到很好的表征。因此，深入了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中涉及的分子機制，將為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供依據(jù)。

CDC6是一種多功能分子開關(guān)，是DNA復(fù)制的重要調(diào)控因子，在細胞周期中具有激活和維持檢查點機制的重要作用。CDC6也是復(fù)制前復(fù)合物的一個組成部分，在G早期DNA復(fù)制的起點形成，在S期開始參與DNA復(fù)制。既往研究表明，CDC6的異常表達在多種人類惡性腫瘤中扮演著重要角色。CDC6在結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中高表達，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)移、放療抵抗等過程。Yu等通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)CDC6低表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)。但多項研究證明，CDC6在腫瘤中過表達，并表明它可能是致癌靶標。例如Kim等研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中

CDC6

mRNA的表達水平明顯高于前列腺增生組織，且CDC6高表達與臨床分期較晚顯著相關(guān)，CDC6表達可能是前列腺癌侵襲性的新指標。Zhang等研究指出，與正常骨髓單核細胞相比，慢性髓系白血病細胞系K562中CDC6的表達明顯上調(diào)，小干擾RNA沉默

CDC6

基因表達可有效抑制K562細胞的增殖，促進細胞凋亡，并誘導(dǎo)細胞周期停滯，CDC6過表達可能涉及慢性粒細胞白血病的致癌活性。Deng等探討了CDC6對上皮性卵巢癌細胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢組織相比，上皮性卵巢癌組織中CDC6蛋白表達水平升高，下調(diào)卵巢癌細胞HO8910中CDC6的表達可抑制細胞增殖和集落形成。本研究中，CDC6在結(jié)直腸癌細胞SW620、LOVO、HT29中的表達明顯上調(diào)，同前述研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，轉(zhuǎn)染

CDC6

siRNA可顯著抑制SW620細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，并降低細胞的侵襲和遷移能力，表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性，與Zhao等的研究結(jié)果相符。這些結(jié)果提示，CDC6是結(jié)直腸癌潛在的預(yù)后標志物和治療靶點。

研究表明，JAK2/STAT3信號通路在肺癌、口腔鱗狀細胞癌、甲狀腺癌等腫瘤的進展中發(fā)揮著重要作用。資料顯示，JAK2/STAT3信號通路參與結(jié)直腸癌SW620細胞的增殖、遷移和侵襲。JAK2和STAT3磷酸化水平的增加會增強SW620細胞的抗凋亡作用。JAK2/STAT3信號通路的激活需要磷酸化，JAK2/STAT3信號通路的激活與肺癌細胞的生長、遷移和侵襲有關(guān)，且可促進腎細胞癌細胞的增殖和遷移并抑制細胞凋亡。本研究中，轉(zhuǎn)染CDC6 siRNA可抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白表達，而對JAK2、STAT3蛋白表達無顯著影響，表明轉(zhuǎn)染CDC6 siRNA通過降低p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達，抑制JAK2/STAT3信號通路活性。此外，激活JAK2/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)了CDC6 siRNA對SW620細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，并逆轉(zhuǎn)了其對細胞凋亡的促進作用。這些結(jié)果提示抑制JAK2/STAT3信號通路活性可能是轉(zhuǎn)染CDC6 siRNA抗結(jié)直腸癌作用的重要途徑之一。

綜上所述，CDC6在結(jié)直腸癌細胞中的表達明顯上調(diào)，RNA干擾抑制CDC6基因表達后可以抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并促進其凋亡，調(diào)控JAK2/STAT3信號通路活性可能解釋了其抗結(jié)直腸癌的作用機制，這為結(jié)直腸癌提供了一個潛在的治療靶標。