胃癌中DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶3A 的表達(dá)與幽門螺桿菌感染的關(guān)系△

楊夢(mèng)迪，王學(xué)紅，潘世銳，馬雪芹，郜茜，綻永華，李源化，李春霞，安琪

1青海大學(xué)研究生院，西寧 810001

2北京市海淀醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100089

3青海大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，西寧 810001

胃癌（gastric cancer，GC）是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生是幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染、環(huán)境和遺傳等多因素共同作用的結(jié)果。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)提供的全球癌癥觀察2018年數(shù)據(jù)估計(jì)，2018年胃癌的發(fā)病率位于全球惡性腫瘤第5位；因胃癌病死的病例約78.3萬，位于惡性腫瘤死亡率第3位；全球近一半的新發(fā)及死亡病例為中國(guó)病例，因此，中國(guó)是胃癌負(fù)擔(dān)較重的國(guó)家之一。Correa等提出的腸型胃癌發(fā)生模式（正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌）已獲得醫(yī)學(xué)界認(rèn)同。Hp感染是胃癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，并在腸型胃癌發(fā)生中起始動(dòng)作用已成為共識(shí)。DNA甲基化受DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的調(diào)控，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生機(jī)制的重要組成部分。本研究以青海胃癌高發(fā)和Hp高感染為研究背景，通過檢測(cè)慢性非萎縮性胃炎（chronic non-atrophic gastritis，CNAG）、慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）、胃腺瘤（gastric adenoma，GA）和GC這4種不同疾病狀態(tài)下患者Hp感染情況及胃黏膜組織中DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3A）mRNA的表達(dá)水平，從而探討兩者與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年11月至2020年5月于青海大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)胃鏡及病理檢查確診的CNAG、CAG、GA、GC患者的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近4周內(nèi)服用過鉍劑、抗生素、中藥及質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）等影響Hp檢出情況的藥物者；②既往接受過Hp感染治療的非初次檢出者。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入CNAG、CAG、GA、GC患者各30例。CNAG患者中，＞60歲12例，≤60歲18例；男20例，女10例。CAG患者中，＞60歲15例，≤60歲15例；男13例，女17例。GA患者中，＞60歲14例，≤60歲16例；男12例，女18例。GC患者中，＞60歲16例，≤60歲14例；男19例，女11例。4種胃部疾病患者的性別與年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 胃黏膜樣本采集 自GC、GA、CAG和CNAG患者的病變部位分別取胃黏膜組織標(biāo)本兩塊，將離體胃黏膜取出后，立即置入凍存管于液氮中速凍，24 h后取出置入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 主要試劑及儀器 2xTaqMan Fast qPCR Master Mix、4SRed Plus核酸染色劑（10 000×水溶液）、瓊脂糖均購(gòu)自BBI生命科學(xué)有限公司，UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，GeneRuler DNA Ladder Mix、Maxima Reverse Transcriptase均 購(gòu) 自 美 國(guó)Thermo Scientific公司，F(xiàn)R-980型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀購(gòu)自上海復(fù)日科技有限公司。

1.2.3 PCR檢測(cè)DNMT3AmRNA的表達(dá) 取凍存標(biāo)本，每15～25 mg凍存樣本中加入0.5 ml Trizol試劑，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察RNA的完整性，采用SMA4000微量分光光度計(jì)檢測(cè)樣本含量及純度，嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)說明書于PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DNMT3A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。以GAPDH作為內(nèi)參基因。GAPDH的上游引物為5'-TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，下游引物為5'-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；DNMT3A上游引物為5'-GCACTGAAATGGAAAGGG-3'，下游引物為 5'-AAGAGGTGGCGGATGACT-3'。采用 2法計(jì)算各樣本的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Hp 的檢測(cè)與判定 采用C尿素呼氣實(shí)驗(yàn)判定患者的Hp感染情況，操作步驟嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行，結(jié)果數(shù)值＞4 dpm提示陽性，即為Hp感染。

1.3 觀察指標(biāo)

比較不同胃部疾病患者胃黏膜組織中DNMT3A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。分析DNMT3A mRNA在不同Hp感染性胃部疾病中的表達(dá)情況，以及不同臨床特征GC患者GC組織中DNMT3A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，DNMT3A的相對(duì)表達(dá)量呈偏態(tài)分布，以中位數(shù)及四分位數(shù)[M（P，P）]表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同胃部疾病患者胃黏膜組織中DNMT3A mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

CNAG、CAG、GA、GC患者胃黏膜組織中DNMT3A mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.70（0.49，1.38）、0.90（0.58，1.80）、1.60（0.74，3.28）、1.70（1.09，3.36）。4組胃部疾病患者胃黏膜組織中DNMT3A mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=22.211，P＜0.01）。隨著病情的發(fā)展（由輕到重依次為CNAG、CAG、GA、GC），DNMT3A mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì)。GC患者胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于CAG和CNAG患者，GA患者胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于CNAG患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。GC與GA、GA與CAG、CAG與CNAG患者之間胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

2.2 DNMT3AmRNA在不同Hp 感染性胃部疾病中的表達(dá)情況比較

在同種疾病胃黏膜組織中，Hp感染胃部疾病患者胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于非Hp感染胃部疾病患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表1）

表1 DNMT3A mRNA在不同Hp感染性胃部疾病中的表達(dá)情況比較

2.3 不同臨床特征GC患者GC組織中DNMT3A mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

低分化、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的GC患者GC組織中

DNMT3A

mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別高于高中分化、不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的GC患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、TNM分期GC患者GC組織中

DNMT3A

mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征GC患者GC組織中DNMT3A mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（n=30）

3 討論

在腫瘤發(fā)生的過程中，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種重要方式，受DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控，在DNA序列中加入或減去胞嘧啶殘基，從而形成5-甲基胞嘧啶。生理狀態(tài)下，CpG島區(qū)處于非甲基化狀態(tài)，但當(dāng)發(fā)生癌變時(shí)，有害因素會(huì)刺激CpG島，使局部發(fā)生甲基化，引起表觀遺傳沉默，從而導(dǎo)致抑癌基因失活，這被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生機(jī)制的重要組成部分。近年來，大量研究證明，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程中，DNA甲基化通過基因修飾和基因調(diào)節(jié)等發(fā)揮重要作用。DNMT3A具有組織特異性，主要通過催化基因組序列使DNA從頭甲基化，建立新的甲基化模式，是腫瘤基因組DNA異常甲基化的重要原因。本研究結(jié)果表明，DNMT3A的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì)，GC患者胃黏膜組織中DNMT3A的相對(duì)表達(dá)量高于CNAG和CAG患者，這一結(jié)果與Cao等的研究結(jié)果一致。本研究納入了癌前胃部疾病患者，發(fā)現(xiàn)GA患者胃黏膜組織中DNMT3A的相對(duì)表達(dá)量較CNAG患者高，但GA患者胃黏膜組織中DNMT3A的相對(duì)表達(dá)量低于GC組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），提示DNMT3A在GA的發(fā)生過程中可能發(fā)揮了一定作用。本研究亦表明，DNMT3A表達(dá)的上調(diào)在胃癌前期即參與了胃癌的發(fā)生，且從慢性炎癥、癌前病變發(fā)展至惡性腫瘤也是一個(gè)從量變到質(zhì)變的過程。然而，動(dòng)態(tài)檢測(cè)胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的表達(dá)情況是否有助于早期胃癌的發(fā)現(xiàn)仍需要進(jìn)一步研究。Hp感染誘導(dǎo)表觀遺傳改變與胃癌相關(guān)基因的異常DNA甲基化有關(guān)。在非家族遺傳性散發(fā)性GC中，慢性Hp感染是主要的驅(qū)動(dòng)事件，約90%的非賁門胃癌新發(fā)病例與此種細(xì)菌有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，由Hp感染引起胃黏膜的表觀遺傳畸變是GC發(fā)生的早期組成部分，甚至可能先于經(jīng)典遺傳突變的發(fā)生。同時(shí)，研究表明，Hp感染可增強(qiáng)胃黏膜DNA異常甲基化，可能是Hp的致癌機(jī)制。Nakajima等發(fā)現(xiàn)Hp感染誘導(dǎo)特異性異常DNA甲基化并促進(jìn)胃癌的發(fā)生，但不改變

DNMT3A

mRNA和蛋白的表達(dá)。Cao等發(fā)現(xiàn)

DNMT3A

rs1550117位點(diǎn)的多態(tài)性與Hp的感染風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)，但與CAG或GC的發(fā)生無明顯相關(guān)性；而

DNMT3A

rs13420827位點(diǎn)的多態(tài)性與Hp感染及CAG或GC的發(fā)生均無明顯相關(guān)性。Yan等發(fā)現(xiàn)，胃癌中存在氧化還原酶的雙色氨酸域基因（WW domain-containing oxi-doreductase，WWOX）的高甲基化，且與Hp感染具有顯著相關(guān)性；進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)GC細(xì)胞株與Hp共培養(yǎng)可誘導(dǎo)

WWOX

啟動(dòng)子甲基化，且DNMT1和DNMT3A的表達(dá)增強(qiáng)。Ding等發(fā)現(xiàn)通過根除Hp治療可降低胃癌組織中核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）等的甲基化水平。但是，目前，關(guān)于Hp與DNMT3A在GC中的相關(guān)性，學(xué)者們意見不一，可能因?yàn)镠p對(duì)

DNMT3A

基因不同單核苷酸多態(tài)性的作用不同，Hp可能不直接改變GC中DNMT3A的表達(dá)水平，而是通過多位點(diǎn)、多基因、多通路使DNMT3A的表達(dá)水平發(fā)生改變，這也說明其關(guān)系的復(fù)雜性及深入研究的必要性。本研究探討了同一胃部疾病患者胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的表達(dá)情況與Hp感染的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Hp感染的GC、GA、CAG和CNAG患者的胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于非Hp感染的同種疾病，提示Hp感染可上調(diào)胃黏膜組織中DNMT3A的表達(dá)。通過對(duì)比Hp感染的4種不同胃部疾病狀態(tài)患者胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，GC患者胃黏膜組織中DNMT3A的相對(duì)表達(dá)量高于CAG和CNAG患者。結(jié)合DNMT3A在不同胃部疾病患者胃黏膜組織中的表達(dá)情況，本研究也證實(shí)胃癌的進(jìn)展涉及長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)生的慢性炎癥、腸化等病理狀態(tài)及腺瘤等癌前疾病，而胃黏膜上皮細(xì)胞Hp的定植會(huì)導(dǎo)致炎癥性癌前病變的發(fā)生，在誘導(dǎo)Correa模式的演變過程中，通過一定機(jī)制在早期即促進(jìn)啟動(dòng)子CpG島區(qū)

DNMT3A

的甲基化表達(dá)，從而進(jìn)一步引起基因修飾等的改變，參與抑癌基因失活的過程，逐漸導(dǎo)致胃癌發(fā)生。本研究初步證實(shí)了Hp感染促進(jìn)胃黏膜組織中DNMT3A高表達(dá)的可能性，也間接證實(shí)了胃癌高發(fā)與Hp高感染有關(guān)。因此，通過規(guī)范抗Hp治療才能根除Hp，從而預(yù)防胃癌。但值得指出的是，本研究中，胃癌患者與非胃癌患者的Hp感染率無顯著性差異，這可能是因?yàn)楸狙芯考{入的樣本量較少，對(duì)于結(jié)果的把握度不足，有可能產(chǎn)生了假陰性結(jié)果，后續(xù)研究中將擴(kuò)大樣本量，避免此類Ⅱ型錯(cuò)誤發(fā)生，且后期將進(jìn)行關(guān)于根除Hp后DNMT3A表達(dá)變化的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、TNM分期GC患者GC組織中

DNMT3A

mRNA分期的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。但低分化、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的GC患者GC組織中

DNMT3A

mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別高于高中分化、不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的GC患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），這與Yang等的研究結(jié)果一致，與其他DNMT相比，DNMT3A的高表達(dá)亦可能通過作用于某些通路或其他靶基因參與腫瘤細(xì)胞的分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)GC的發(fā)展。綜上所述，Hp感染胃黏膜上皮細(xì)胞后，可誘導(dǎo)

DNMT3A

mRNA高表達(dá)。Hp感染及DNMT3A高表達(dá)可協(xié)同作用，通過不同途徑參與從正常胃黏膜上皮細(xì)胞向癌前疾病甚至胃癌方向發(fā)展的過程。DNMT3A表達(dá)的上調(diào)可能促進(jìn)癌前病變進(jìn)展為胃癌，且其高表達(dá)與胃癌的發(fā)展密切相關(guān)。本研究為探索胃癌高發(fā)情況以及DNMT3A、Hp在GC中的致病機(jī)制提供了一定理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。