新疆地區(qū)APOE基因多態(tài)性與子癇前期相關(guān)性分析

陳紅艷，段茉莉，張欣文，陳超，顏樺

（1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院國(guó)家微檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710127；2.西安市第四醫(yī)院婦女保健科，陜西 西安 710016；3.烏魯木齊市婦幼保健院婦產(chǎn)科，新疆 烏魯木齊 830001）

子癇前期是典型的妊娠多系統(tǒng)疾病，其特征是由深層血管收縮和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活引起的胎盤(pán)灌注減少，這些病理生理變化可能與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有關(guān)[1]。脂質(zhì)和脂蛋白代謝紊亂可能促進(jìn)氧化應(yīng)激和血管功能障礙，從而誘發(fā)子癇前期的發(fā)生[2]。與正常孕婦相比，子癇前期婦女的脂質(zhì)分布異常，富含甘油三酯（TG）的脂蛋白濃度升高[3]，可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。由于子癇前期疾病史的家庭發(fā)病率更高[4]，因此，某些遺傳因素可能參與其病因。目前關(guān)于子癇前期的遺傳基礎(chǔ)仍不清楚。

載脂蛋白E（ApoE）在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。人類(lèi)APOE 基因位于染色體19q13.2 上，共含有4 個(gè)外顯子，主要存在3 個(gè)等位基因（APOE ε2，APOE ε3 和APOE ε4），以及6種基因型（E2/2，E2/3，E2/4，E3/3，E3/4和E4/4）。APOE基因多態(tài)性導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常，已知與神經(jīng)退行性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化及其他心血管疾病有關(guān)[5-7]。關(guān)于A(yíng)POE基因多態(tài)性與子癇前期易感性的關(guān)系有很多報(bào)道，然而，不同地區(qū)的結(jié)果并不一致。有文獻(xiàn)[8-10]結(jié)果表明，APOE基因多態(tài)性是子癇前期發(fā)生的可能危險(xiǎn)因素。然而，也有文獻(xiàn)[3，11-15]結(jié)果表明APOE 基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，甚至有文獻(xiàn)[16]表明APOEε2 等位基因?qū)ψ影B前期發(fā)生有保護(hù)作用，因此，APOE基因多態(tài)性與子癇前期的關(guān)聯(lián)仍有待了解。本研究通過(guò)對(duì)新疆地區(qū)重度子癇前期、輕度子癇前期和正常人群APOE 基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討新疆地區(qū)APOE 基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究共招募387名女性受試者（280名健康孕婦（正常組）、81例重度子癇前期患者（重度子癇前期組）和26例輕度子癇前期患者（輕度子癇前期組）。2016年1月至2016年10月，所有參與者在新疆維吾爾自治區(qū)婦幼保健院接受檢查和治療。子癇前期組選擇及診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《妊娠期高血壓診治指南（2015）》[17]。正常組納入標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期血壓無(wú)異常（血壓＜140/90 mmHg）；孕婦無(wú)慢性高血壓、子癇前期、糖尿病、心臟病、肝病和腎病病史；妊娠輔助檢查：血/尿常規(guī)、肝腎功能正常。本研究經(jīng)西北大學(xué)倫理委員會(huì)和新疆維吾爾自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。獲得所有參與者的知情同意。

1.2 樣本采集及血脂指標(biāo)測(cè)定 所有受試者于分娩前，基礎(chǔ)狀態(tài)下，采集空腹靜脈血4 mL，其中2 mL注入干燥管，分離血清，采用日立全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血脂指標(biāo)，血清總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平測(cè)定采用CHOD-PAP法和GPOPAP法試劑盒（寧波瑞源）。剩余2 mL注入EDTA抗凝管，待提取DNA。

1.3 載脂蛋白E的基因分型 采用QIAamp DNA血液迷你試劑盒（凱杰）從200 μL EDTA抗凝外周血中提取基因組DNA樣本。提取的基因組DNA 溶解在洗脫緩沖液（10 mM Tris HCl，0.5 mM EDTA，pH 9.0）中，使用nanodrop分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度（賽默飛世爾），-20 ℃保存。

等位基因特異性PCR（AS-PCR）：每個(gè)樣本同時(shí)設(shè)置兩個(gè)平行的PCR反應(yīng)體系，分別對(duì)應(yīng)該SNP位點(diǎn)的兩種堿基形式，APOE*4（rs4293581）使用C 反應(yīng)體系與T 反應(yīng)體系，APOE*2（rs7421）使用G反應(yīng)體系與A反應(yīng)體系。引物序列，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體積為20 μL，擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，55 ℃延伸40 s（收集熒光），72 ℃退火40 s，40 個(gè)循環(huán)。最后根據(jù)樣本在兩反應(yīng)體系中的FAM 通道擴(kuò)增表現(xiàn)判斷基因型。引物序列，見(jiàn)表1。

表1 APOE基因型檢測(cè)引物序列Table 1 APOE genotype detection primer sequence

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Hardy-Weinberg平衡（H-W）對(duì)正常組樣本基因分型結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)量資料以“±s”表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；APOE 基因型和等位基因頻率比較采用Person卡方檢驗(yàn)，相對(duì)危險(xiǎn)度采用比值比（OR）和95%CI；血脂水平比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APOE等位基因在世界不同地區(qū)健康孕齡婦女中的分布APOE基因多態(tài)性與子癇前期相關(guān)性已得到最廣泛的研究，但不同地域研究的結(jié)論并不一致。為了明確APOE等位基因頻率在世界各地的分布情況，對(duì)已發(fā)表文獻(xiàn)正常組樣本中APOE等位基因的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共納入10篇文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，新疆地區(qū)健康人群APOEε2、ε3、ε4 等位基因頻率分別為8.92%、80.05%和11.03%，ε2、ε3等位基因頻率與南非地區(qū)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），ε4等位基因頻率與南非、中國(guó)廣東、芬蘭和伊朗地區(qū)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 APOE等位基因在世界不同地區(qū)健康孕齡婦女中的分布Table 2 Distribution of the ApoE allele in healthy women of gestational age from different regions of the world

2.2 正常組和病例組APOE等位基因和基因型分布及H-W平 衡檢驗(yàn) 為了驗(yàn)證本次納入的研究對(duì)象是否來(lái)自同一個(gè)群體，將APOE基因型分布進(jìn)行H-W平衡檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，基因型在正常組（漢族、維吾爾族、回族、哈薩克族及總樣本）和病例組（重度子癇前期和輕度子癇前期）的分布均符合H-W 平衡。說(shuō)明研究樣本符合群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)具有良好的群體代表性，見(jiàn)表3。

表3 正常組和病例組APOE等位基因和基因型分布及H-W平衡檢驗(yàn)Table 3 APOE allele and genotype distribution and H-W balance test in normal group and patient group

2.3 3 組孕婦臨床特征比較 與正常組相比，重度子癇前期組和輕度子癇前期組甘油三脂和總膽固醇水平更高（P＜0.05），但重度子癇前期組和輕度子癇前期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

表4 3組孕婦臨床特征比較Table 4 Comparison of general clinical characteristics among three groups

2.4 APOE基因多態(tài)性與子癇前期（重度/輕度）發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究 APOE 基因多態(tài)性與子癇前期相關(guān)性分析結(jié)果，經(jīng)過(guò)卡方檢驗(yàn)分析，APOE的等位基因頻率分布在重度子癇前期組[ε2vs.ε3：OR=1.29（0.71～2.37），P=0.42；ε4vs.ε3：OR=0.80（0.42～1.54），P=0.51]和輕度子癇前期組[ε2vs.ε3：OR=0.72（0.22～2.42），P=0.80；ε4vs.ε3：OR=0.80（0.28～2.30），P=0.86]與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以顯性模式進(jìn)行基因型分布分析，重度子癇前期組[E2/2+E2/3vs. E3/3：OR=1.33（0.67～2.63），P=0.42；E3/4+E4/4vs. E3/3：OR=0.88（0.43～1.81），P=0.72]和輕度子癇前期組[E2/2+E2/3vs. E3/3：OR=0.82（0.23～2.93），P=1.00；E3/4+E4/4vs. E3/3：OR=0.89（0.47～1.69），P=0.72）與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 3 種等位基因攜帶者在正常組和重度/輕度子癇前期組中血脂水平分別比較正常組和子癇前期組中APOE ε2、ε3 和ε4 等位基因攜帶者的血脂指標(biāo)差異，發(fā)現(xiàn)重度子癇前期組中，ε2 和ε4 等位基因攜帶者的甘油三酯水平高于ε3，且ε2等位基因攜帶者的甘油三酯水平與ε3比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。

3 討論

APOE基因多態(tài)性與子癇前期之間的相關(guān)性已在國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了廣泛的研究，然而，不同地區(qū)的結(jié)果并不一致。本研究調(diào)查世界不同地區(qū)健康孕齡婦女中APOE等位基因頻率的分布差異，研究結(jié)果證明，APOE ε2、ε3和ε4等位基因的分布具有顯著的地域差異。新疆地區(qū)位于我國(guó)西北內(nèi)陸地區(qū)，自然地理環(huán)境獨(dú)特，因此相比于我國(guó)其他地區(qū)，該地區(qū)人群的APOE基因多態(tài)性分布及與子癇前期發(fā)生的相關(guān)性可能有其特殊性。

雖然子癇前期是一種多因素疾病，但具有家族聚集的一般趨勢(shì)，表明遺傳因素可能發(fā)揮重要作用。ApoE 是血脂異常和動(dòng)脈粥樣硬化的已知遺傳標(biāo)記，在脂質(zhì)代謝中具有重要作用。一項(xiàng)META分析報(bào)告證明，E2/2+E2/3和E3/4+E4/4基因型的受試者TG 水平高于E3/3 受試者[18]。本研究結(jié)果表明，相比于ε3，ε2等位基因攜帶者的甘油三酯水平顯著升高（P＜0.05）。推測(cè)APOE 基因多態(tài)性與重度子癇前期孕婦脂質(zhì)變化可能有關(guān)。由于A(yíng)POE基因多態(tài)性與脂質(zhì)譜之間的關(guān)系可能受未經(jīng)調(diào)整的環(huán)境因素的影響，因此，有必要通過(guò)擴(kuò)大樣本量、校正環(huán)境因素進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究共納入正常組280例和子癇前期組107例，為了避免納入樣本的異質(zhì)性造成的偏倚，將病例分為輕度子癇前期組和重度子癇前期組。研究結(jié)果表明，APOE 基因多態(tài)性與輕度子癇前期和重度子癇前期均無(wú)相關(guān)性。結(jié)合近期一項(xiàng)META分析證明APOE基因與子癇前期的發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)間的相關(guān)性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[19]，因此，在新疆地區(qū)，APOE 基因多態(tài)性在子癇前期的發(fā)展中似乎無(wú)關(guān)鍵作用。事實(shí)上，子癇前期并沒(méi)有一個(gè)單一的遺傳原因，母體基因型是導(dǎo)致易感性的主要因素，但胎兒的基因型也可能參與其中[20]。家族研究表明，遺傳和環(huán)境因素共同影響脂質(zhì)代謝的變異[21]。本研究結(jié)論仍需通過(guò)更大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

表5 3種等位基因攜帶者在正常組和重度/輕度子癇前期組中血脂水平（±s，mmol/L）Table 5 Lipid levels in carriers of the three alleles in the normal and severe/mild preeclampsia groups(±s,mmol/L)

表5 3種等位基因攜帶者在正常組和重度/輕度子癇前期組中血脂水平（±s，mmol/L）Table 5 Lipid levels in carriers of the three alleles in the normal and severe/mild preeclampsia groups(±s,mmol/L)

組別正常組（n=280）重度子癇前期組（n=81）輕度子癇前期（n=26）生化指標(biāo)甘油三酯總膽固醇甘油三酯總膽固醇甘油三酯總膽固醇ε32.27±0.133.59±1.364.08±1.386.38±2.053.80±0.836.16±1.81 ε22.28±0.153.24±1.275.15±1.536.37±1.263.44±0.715.50±1.75 ε42.29±0.133.79±1.054.10±0.986.53±1.013.56±0.215.76±2.91 F值0.3531.6043.2150.0310.3170.174 P值0.7030.2030.0460.9690.7320.841