大黃對MCAO模型大鼠的神經(jīng)保護作用

孫春曉，黃嘉慧，譙 麗，劉俊杰，唐宇恒，許阿娟，聶婧雯，黃私迎，羅 銳，楊澤霖，賴文芳，洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

缺血性腦卒中是醫(yī)學(xué)史上未解的難題之一，致病機理主要是由于腦動脈血管栓塞進而誘發(fā)炎癥反應(yīng)的級聯(lián)過程[1]。大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型是對臨床上常見的缺血性腦卒中疾病的模擬，它具有較低的侵入性，同時也是最接近人類缺血性中風(fēng)的一種技術(shù)[2]。

大黃在我國擁有悠久的藥用歷史，根據(jù)2015版藥典描述，大黃是蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根和根莖，通常用于清熱瀉火、涼血解毒等作用，同時，藥典中收錄的大黃蟄蟲丸、逐瘀通脈膠囊以及麝香腦脈康膠囊等諸多制劑也顯示著大黃在治療腦中風(fēng)方面有著獨特的作用[3]。有學(xué)者認為，大黃作為瀉火、涼血熱藥，具有抗炎、抗毛細血管凝血和止血的作用，具有直接作用于腦部的可能性[4]。此外，大黃素、大黃酚作為其主要活性成分，也是大黃藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要標志物之一。Ye等[5]指出，不同劑量的大黃素連續(xù)作用于SD大鼠13周，無明顯毒性。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)大黃素可明顯抑制腦中風(fēng)的炎性損傷[6]，趙薇等[7]指出大黃酚可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制細胞凋亡起到神經(jīng)保護作用。而關(guān)于大黃提取物對腦損傷的研究目前較少，本文主要通過研究大黃提取物對MCAO大鼠的神經(jīng)保護作用，并進一步探討其作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級(Sprague Dawley(SD)大鼠，♂，體質(zhì)量(260-280)g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[合格證號：2015000510392，許可證號：SCXK(滬)2012-0002]，并于福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心喂養(yǎng)[許可證號：SYXK(閩)2014-0005]。

1.2 藥物與試劑大黃，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室鑒定。DAPI染色液(貨號：C1006)，抗熒光淬滅封片液(貨號：P0126)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液粉末(貨號：17032701)，檸檬酸鹽緩沖液粉末(貨號：17021404)均購自邁新生物技術(shù)有限公司；尼氏染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，貨號：DK0022)；NeuN 抗體 (貨號:ab104224)；BDNF 抗體 (貨號：ab205067)均購自美國Abcam公司；NGF抗體(sc-365944)均購自Santa Cruz公司； cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司，貨號：K1622)；兔抗(貨號：31460)，鼠抗(貨號：31430)均購自Thermo Scientific公司；β-action抗體(貨號AF0003)購自碧云天生物科技有限公司。

1.3 儀器基礎(chǔ)電泳儀電源(美國Bio-Rad公司)；小型轉(zhuǎn)印槽(美國Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司，型號：DMI8)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，型號：ChemiDocXRS+)；紫外可見分光光度計(Thermo Fisher公司，型號：ND2000C)；普通PCR儀(美國Bio-Rad公司，型號：C1000)；實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司，型號：7900H-PCR)；石蠟切片機(Thermo Fisher公司，型號：HM325)；生物組織石蠟包埋機(Thermo Fisher公司，型號：YB-6LF)；3600AAA，3800AAA尼龍線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 大黃提取物制備稱取大黃干燥根莖200 g，粉碎后裝入500 mL圓底燒瓶，采用250 mL 95%乙醇加熱回流提取2 h，取2次上層提取液合并減壓濃縮揮干即得相應(yīng)的粉末(1 g相當于生藥含量10 g)[8]。使用含有質(zhì)量濃度為10 g·L-1的羧甲基纖維素鈉的生理鹽水溶解粉末使成30 g·L-1懸濁液備用[9]。

2.2 動物分組與處理健康成年♂實驗動物隨機分為假手術(shù)組(sham)、模型組(MCAO)、大黃給藥組(MCAO+大黃)，每組15只。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周以后，2%的戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，采用線栓法制備模型，沿大鼠頸線中部切開，分離出頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，將頸總動脈和頸外動脈用醫(yī)院縫合線結(jié)扎，用動脈夾夾住頸內(nèi)動脈，用動脈剪在頸總動脈遠心端剪一個V形切口，將線栓自頸總動脈切口處插入頸內(nèi)動脈，至大腦中動脈起始端，用縫合線縫合切口。2 h后拔出線栓實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組做相同處理除不插線栓。大鼠清醒后進行神經(jīng)功能評分，評分在2-3分視為造模成功[14]。大黃給藥組灌服大黃提取物溶液200 mg·kg-1·d-1，其余組則灌服等體積生理鹽水。連續(xù)給藥6 d后取材。

2.3 取材及前處理給藥治療6 d后，2 %的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，每組7只動物腹主動脈取血后于心尖上剪一小缺口，將灌胃針自缺口插入動脈，在右心耳剪一缺口，滴注生理鹽水至右心耳流出無色液體滴注甲醛至大鼠腦僵硬，取腦于4 %多聚甲醛中室溫固定24 h后，使用專門的腦模具和切片刀將腦組織平均分為6片，保存于70 %的乙醇中，待后續(xù)進行免疫熒光實驗。每組7只動物腹主動脈取血后斷頭取腦，將大腦分左右腦，分裝于液氮中保存?zhèn)溆?。取左腦腦組織磨成粉末，分裝待用。

2.4 尼氏染色法檢測尼氏體的表達將保存的腦組織脫水、包埋，即可獲得組織蠟塊。將組織蠟塊以3 μm厚度切片，平整攤在40 ℃蒸餾水中，待組織片無褶皺后用載玻片撈片，55 ℃烤片，待無水分時移至60 ℃暗箱內(nèi)6 h待用。取用準備好的組織片經(jīng)過脫蠟復(fù)水，在56 ℃溫箱內(nèi)，于含有焦油紫的染缸中浸染30 min，之后在酒精燈上加溫至切片冒泡約10 min，用去離子水洗去染液后用尼氏分化液分化1-3 min，之后使用無水乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明，晾干后用中性樹脂封片，在鏡下觀察結(jié)果并拍照留存，使用圖像分析軟件Motic Med 6.0測定腦梗死體積。

2.5 免疫熒光法檢測腦組織中NeuN、NF200的表達將保存好的組織片脫蠟復(fù)水，在檸檬酸緩沖液中抗原修復(fù)，待自然冷卻到室溫后，用5 %BSA室溫封閉2 h后，稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，次日取出組織片待復(fù)溫40 min后，用PBS洗3次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h后(之后避光操作)，PBS洗3次，每次10 min，之后DAPI染核8 min，再次使用PBS洗3次，每次10 min，最后滴加抗淬滅劑后封片，結(jié)果使用熒光倒置顯微鏡觀察。

2.6 RT-qPCR法檢測Egr1、Egr2、Egr4 mRNA的表達取30 mg組織采用TRIzol提取總RNA，-80 ℃保存待用。根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，放于-80 ℃保存待用。使用RT-qPCR技術(shù)檢測Egr1、Egr2、Egr4 mRNA的表達的表達水平。GADPH的上游引物：5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物：5′-GAAGACGCCAGTAGACTVVACGAC-3′；Egr1的上游引物：5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′，下游引物：5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′；Egr2的上游引物：5′-ACCAGGAGAATCCATACCAGAACC-3′，下游引物：5′-AGGAGGACACGATAGACAGACAAAG-3′；Egr4的上游引物：5′-AAGCTGGAGCAGGAAGAGGTTG-3′，下游引物：5′-GCAGGGAGGAGGTTTTGGATAG-3′，RT-qPCR所用引物由尚亞生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成。以GAPDH為內(nèi)參校正每個樣品的Ct值，計算2-ΔΔCt值從而對基因表達進行定量分析。

2.7 Western blot檢測NGF、BDNF蛋白的表達取100 mg組織提取總蛋白，根據(jù)SDS-PAGE凝膠電泳配置說明書選擇合適濃度配比的分離膠。電泳，轉(zhuǎn)膜，將目標蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，5 % BSA室溫封閉2 h，稀釋的一抗4 ℃搖床孵育過夜，Tris-HCI Buffer Solution Tween (TBST)洗3次，每次10 min，稀釋的二抗室溫搖床孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min，之后使用凝膠成像分析系統(tǒng)Image Lab 6.0成像并檢測分析目標條帶灰度值，計算條帶與β-actin灰度值的比值并統(tǒng)計分析各組差異。

3 結(jié)果

3.1 大黃提取物對MCAO模型大鼠的缺血側(cè)腦梗死體積的影響MCAO模型大鼠再灌注1 h后，經(jīng)大黃提取物連續(xù)給藥6 d，尼氏染色結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO模型大鼠梗死冠狀切面梗死面積及梗死體積升高，經(jīng)大黃提取物作用后，MCAO模型大鼠腦梗死體積被明顯改善(P<0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Effect of rhubarb extract on ischemic lateral cerebral infarction volume in MCAO model **P<0.10 vs Sham

3.2 大黃提取物對MCAO模型大鼠的缺血側(cè)神經(jīng)生長因子NeuN表達的影響MCAO模型大鼠再灌注1 h后，經(jīng)大黃提取物連續(xù)給藥6 d，免疫熒光結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO模型大鼠NeuN的數(shù)目減少，經(jīng)大黃提取物作用以后，NeuN的數(shù)目增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 2。

Fig 2 Effect of rhubarb extract on expression of nerve growth factor NeuN in ischemic side of MCAO #P<0.01 vs sham

3.3 大黃提取物對MCAO模型大鼠的缺血側(cè)腦組織NF200表達的影響MCAO模型大鼠再灌注1 h后，經(jīng)大黃提取物連續(xù)給藥6 d，免疫熒光結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO模型大鼠NF200的數(shù)目降低，經(jīng)大黃提取物作用以后，NF200的數(shù)目增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 3。

3.4 大黃提取物對MCAO模型大鼠缺血側(cè)腦組織Egr1，Egr2，Egr4 mRNAMCAO模型大鼠再灌注1 h后，經(jīng)大黃提取物連續(xù)給藥6 d，RT-qPCR的結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO模型大鼠Egr1、Egr2、Egr4 mRNA表達降低，經(jīng)大黃提取物作用以后，Egr1、Egr2、Egr4 mRNA表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見Fig 4。

3.5 大黃提取物對MCAO模型大鼠缺血側(cè)腦組織NGF、BDNF蛋白表達的影響MCAO模型大鼠再灌注1 h后，連續(xù)給藥6 d，Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO模型大鼠NGF、BDNF蛋白表達量降低，經(jīng)大黃提取物作用后，該作用被逆轉(zhuǎn)且差異具有顯著性(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 3 Effect of rhubarb extract on expression of NF200 on ischemic brain tissue of MCAO model rats(×400) **P<0.01 vs sham

Fig 4 Effects of rhubarb extract on expression of Egr1,Egr2 and Egr4 mRNA in ischemic brain tissue #P<0.01 vs sham

Fig 5 Effect of rhubarb extract on expression of NGF(A) and (B) BDNF protein in ischemic brain tissue of MCAO model #P<0.01 vs sham

4 討論

本實驗中使用線栓法制造模型，線栓法造模具有操作簡單、重復(fù)性好、可控制缺血/再灌注時間、損傷小等優(yōu)點[10]。造模成功后的實驗大鼠表現(xiàn)出行走時向病灶對側(cè)跌倒或原地轉(zhuǎn)圈，甚至不能自發(fā)行走，意識功能障礙，經(jīng)大黃提取物連續(xù)給藥6 d，發(fā)現(xiàn)與MCAO模型組相比，大黃給藥組能明顯改善MCAO模型大鼠神經(jīng)功能障礙損傷。同時我們采用尼氏染色檢測大鼠腦梗死體積發(fā)現(xiàn)，MCAO模型大鼠的腦梗死體積明顯增加，而經(jīng)大黃提取物連續(xù)治療6 d后腦梗死體積明顯改善。

神經(jīng)核蛋白(neuronal nuclear protein，NeuN)是有絲分裂后和新生的成熟神經(jīng)元的標志物，可以在大多數(shù)神經(jīng)元中檢測到。大量研究表明其在腦缺血/再灌注損傷后表達量明顯下降[11]。免疫熒光結(jié)果顯示，經(jīng)大黃提取物治療以后可以增加缺血側(cè)腦組織NeuN的表達，表明大黃提取物對于MCAO模型大鼠的神經(jīng)元損傷具有抑制作用。為了進一步證明大黃提取物對于MCAO模型大鼠的神經(jīng)保護作用，我們檢測了MCAO模型大鼠缺血側(cè)腦組織區(qū)域成熟神經(jīng)細胞表型標記物高分子量神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament 200，NF200)的表達。NF200主要存在于神經(jīng)元細胞質(zhì)及軸突中，具有髓鞘軸突并對機械刺激作出反應(yīng)，神經(jīng)元細胞的數(shù)量及其功能狀態(tài)被它的表達量的高低所反映[12]。結(jié)果顯示，MCAO模型后，大鼠神經(jīng)細胞內(nèi)NF200表達量減少，大黃提取物連續(xù)作用6 d后，該作用被逆轉(zhuǎn)，表明大黃提取物可以保護神經(jīng)細胞。

早期生長反應(yīng)蛋白( early growth responses，Egrs)是鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，包括Egr1、Egr2和Egr4，它們共享幾乎相同的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并結(jié)合到一個共同的Egr反應(yīng)元件共有序列[13-14]。文獻報道，Egr1、Egr2和Egr4與神經(jīng)元存活密切相關(guān)[15]。同時神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)對神經(jīng)的發(fā)生和可塑性也具有重要的作用[14]。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)胚胎期缺乏NGF會增加小鼠神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)細胞的凋亡。Song等[16]表明增加的NGF和BDNF表達可能有助于在急性腦損傷和中風(fēng)早期觀察到的神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)保護作用。根據(jù)RT-qPCR及Western blot結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)大黃提取物可以顯著促進MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織的Egr1、Egr2、Egr4、NGF及BDNF的表達，促進神經(jīng)元的再生。

綜上，大黃提取物可以通過促進Egrs、NGF及BDNF的表達，促進神經(jīng)元的再生，進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，為大黃治療缺血性腦損傷的研究提供新的基礎(chǔ)。