配伍對芒果苷在INS-1細胞藥代動力學的影響及其在細胞內(nèi)的分布

方 佳，周 鴻，黎梓霖，林愛華，劉奕明,3

(廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 1.Ⅰ期臨床研究室、2. 珠海醫(yī)院、3. 廣東省中醫(yī)證候臨床研究重點實驗室，廣東 廣州 510120)

知母-黃柏藥對最早出自金·李杲《蘭室秘藏》，是用于治療糖尿病的經(jīng)典藥對[1]。黃柏為蕓香科植物黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid)的干燥樹皮，習稱“川黃柏”，具有抗菌、抗氧化和降糖等作用[2]。知母為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge)的干燥根莖，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和降血糖等作用[3]。

知母的主要有效成分之一芒果苷，是一種具有C-糖苷和氧雜蒽酮成分的天然化合物，具有多種藥理活性，如降血糖[4]、調(diào)節(jié)脂代謝[5]，抗氧化[6]，提高線粒體生物能量[7]等。我們研究發(fā)現(xiàn)[8-9]，知母配伍黃柏給大鼠用藥后，芒果苷血藥濃度明顯低于單用知母，而在胰腺組織中藥物濃度卻顯著升高。選擇大鼠胰島素瘤細胞INS-1細胞進行芒果苷單體的細胞藥代動力學研究[10]，發(fā)現(xiàn)芒果苷的Cmax和AUC(0-t)隨劑量增大而增加，在細胞被氧化損傷后明顯降低。然而知母黃柏配伍對芒果苷在細胞內(nèi)含量的影響，以及芒果苷進入細胞后如何分布尚不清楚。因此本研究繼續(xù)選擇INS-1細胞，進一步考察配伍對芒果苷在INS-1細胞藥代動力學特征的影響；以及相同劑量的芒果苷在正常和氧化損傷的INS-1細胞內(nèi)的分布變化，為進一步解釋芒果苷的藥理作用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要藥品與試劑芒果苷對照品(批號：111607-200301，純度HPLC>98%)，中國藥品生物制品檢定所；蘆丁對照品(批號：O0714AS，純度HPLC>98%)，大連美侖生物技術有限公司；細胞核/線粒體分離試劑盒(批號：20190516，江蘇凱基生物有限公司)；PBS緩沖液，美國Hyclone公司；過氧化氫(H2O2)、噻唑藍(MTT)粉末、二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、青/鏈霉素溶液(雙抗)、南美胎牛血清、0.25%胰酶均來自美國Gibco公司；冰醋酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)；知母(批號：170408241，產(chǎn)地河北)、黃柏(批號：170500301，產(chǎn)地四川)，廣東康美藥業(yè)股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術公司；甲醇、乙腈(美國默克公司)均為HPLC色譜純；水為Milli-Q超純水。

1.2 主要儀器QTRAP 6500+型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)，配備SHIMADZU LC-30AD高效液相色譜(日本島津公司)、Turbo Ionspray離子源(ESI)及Analyst 1.7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國AB Sciex公司)；Sonics VCS 105型超聲波細胞破碎儀(美國Sonics公司)；真空冷凍干燥儀(Christ Alpha2-4LSC-Plus，德國Christ公司)；5430R高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；VICTOR X5酶標儀(美國PerkinElmer公司)；BF2000-30A氮氣吹干儀(北京八方世紀科技有限公司)；Allegra X-22R型多功能臺式冷凍離心機、Microfuge 16型臺式微量離心機(美國Beckman Coulter公司)；AB135-S型十萬分一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.3 實驗細胞INS-1細胞為大鼠胰島素瘤細胞，購于北京北納生物科技有限公司。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1知母-黃柏藥液 將藥材粉碎至適當細度過篩，知母黃柏各45.0 g(1 ∶1)，加純水至360 mL，浸泡30 min后，回流裝置煎1 h，過濾收集藥液，提取兩次，合并兩次藥液后濃縮至90 mL，置于-80 ℃冰箱預冷后冷凍干燥48 h，得到知母-黃柏藥對凍干粉(含芒果苷14.0 mg·g-1)，密封于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；用時采用完全培養(yǎng)基溶解并稀釋至所需濃度。

2.1.2知母藥液 將藥材粉碎至適當細度過篩，稱量知母45.0 g，其他處理同“2.1.1”，最終得到知母凍干粉(含芒果苷21.8 mg·g-1)，4 ℃冰箱密封保存；用時采用完全培養(yǎng)基溶解并稀釋至所需濃度。

2.1.3芒果苷 精密稱取芒果苷42.23 mg溶于0.5 mL DMSO中，吹勻使其完全溶解，得到濃度為200 mmol·L-1的芒果苷母液，保存于-20 ℃冰箱；用前采用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

2.2 不同給藥方式的芒果苷細胞藥代動力學實驗

2.2.1細胞給藥與收集 將生長至對數(shù)期的細胞，種于24孔板，每組每個時間點設6孔，每孔約1.0×105個細胞，孵育24 h后，芒果苷單體、知母、知母-黃柏藥對分別給藥(劑量以芒果苷計為7 mg·L-1)，給藥前取空白細胞，給藥后分別在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h收集細胞，PBS緩沖液清洗3遍后，加入120 μL滅菌超純水，反復凍融3遍后超聲裂解細胞，-80 ℃保存。

2.2.2細胞樣本處理 取出凍存的樣品于冰面解凍，4 ℃，12 000 r·min-1，離心15 min。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明操作，測定蛋白濃度，然后固定蛋白量至5 g·L-1。取100 μL固定蛋白量的細胞裂解樣品，加入內(nèi)標蘆丁(218 μg·L-1)10 μL，混勻后加入400 μL乙腈 ∶乙酸(V/V40 ∶1)，振蕩3 min，14 800 r·min-1離心10 min，取400 μL上清N2吹干，殘渣加200 μL 40%甲醇復溶，振蕩3 min，14 800 r·min-1離心10 min，取上清過膜，進行LC-MS/MS分析。

2.3 芒果苷在INS-1細胞內(nèi)的分布實驗

2.3.1細胞樣品采集 將生長至對數(shù)期細胞種于15 cm培養(yǎng)皿中，每孔約5.0×106個細胞，設置對照組和模型組，每組每個時間點設6皿，孵育24 h后模型組加入10 mL 140 μmol·L-1H2O2進行氧化損傷造模，對照組加入等體積全培。造模1 h后，吸取上清丟棄，均給藥10 mL 100 μmol·L-1芒果苷，給藥前取空白細胞，給藥后分別在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48 h收集細胞，PBS緩沖液清洗3遍后，加入1.5 mL 預冷的 Lysis Buffer，刮下細胞，將細胞懸液反復凍融3遍后超聲裂解細胞，于-80 ℃保存。

2.3.2細胞核/線粒體的提取處理 將細胞懸液取出于冰面上解凍，按照細胞核/線粒體分離試劑盒操作說明，分離細胞核、線粒體和胞質(zhì)，于-80 ℃保存。用時取出冰上溶解，處理方法同“2.2.2”。

2.4 細胞藥物濃度測定采用已建立的LC-MS/MS方法[10]測定樣品的芒果苷濃度。以蘆丁為內(nèi)標，色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)；流動相為1%冰乙酸(A)-甲醇(B)；梯度洗脫條件為0～2.0 min：20% B；2.0～4.0 min：20%～70% B；4.0～4.5 min：70%～20% B；4.5～7.0 min：20% B，流速0.3 mL·min-1。檢測方式為正離子多離子反應監(jiān)測(MRM)，用于定量分析的離子對分別為：m/z 423.0→273.2(芒果苷)；m/z 611.5→303.0(內(nèi)標蘆丁)。

經(jīng)方法學考察，細胞內(nèi)源性物質(zhì)不會干擾MGF和內(nèi)標的測定；MGF在2～500 μg·L-1內(nèi)，線性關系良好(r=0.996 5)，定量下限為2 μg·L-1；定量下限、低、中、高4個濃度MGF質(zhì)控樣品日內(nèi)RSD均≤9.40%，日間RSD均≤14.49%，提取回收率均≥86.32%，準確度在93.97%～103.54%，均符合生物樣品藥物濃度測定方法學要求。MGF濃度根據(jù)隨行標準曲線計算，并隨行低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析采用DAS 2.0軟件根據(jù)非房室模型進行數(shù)據(jù)處理，計算出各藥物代謝動力學參數(shù)Cmax、Tmax、AUC、T1/2等，其中Tmax和Cmax為實測值，AUC用梯形法計算。用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，以t檢驗比較兩組間差異，單因素方差分析法進行多組間比較。

3 結果

3.1 配伍對芒果苷細胞藥代動力學的影響

3.1.1芒果苷單體、知母、知母-黃柏藥對給藥后芒果苷的藥時曲線 INS-1細胞單次給藥芒果苷單體(mangiferin，MGF)、知母(Zhimu，ZM)、知母-黃柏藥對(Zhimu-Huangbai herb pair，ZB)后，芒果苷均較快進入細胞，并出現(xiàn)多個峰，約在4-6 h達到濃度峰值。從細胞內(nèi)平均藥物濃度-時間曲線(Fig 1)可見，芒果苷單體組濃度最低，知母組次之，藥對組濃度最高，配伍黃柏使知母中芒果苷細胞內(nèi)濃度明顯升高。

Fig 1 Mean drug concentration-time curves of mangiferin after single administration of mangiferin,Zhimu and Zhimu-Huangbai in INS-1 cells(n=6)

3.1.2芒果苷單體、知母、知母-黃柏藥對給藥后芒果苷的藥代動力學參數(shù) INS-1細胞單次給藥芒果苷單體、知母、知母-黃柏藥對后芒果苷的藥動學參數(shù)見Tab 1。單次給藥INS-1細胞芒果苷單體后，細胞內(nèi)芒果苷Cmax較低；給藥知母后，芒果苷Cmax和AUC(0-t)比單體組升高，但差異均無統(tǒng)計學意義。藥對給藥后，平均駐留時間MRT(0-t)和T1/2基本不變；Cmax比知母組升高，且高于單體組(P<0.01)；AUC(0-t)則明顯高于單體組和知母組(P<0.01)，提示配伍黃柏對知母有效成分芒果苷進入INS-1細胞具有一定的促進作用。

3.2 芒果苷在INS-1細胞內(nèi)的分布

3.2.1芒果苷在正常和模型組INS-1細胞內(nèi)分布的藥時曲線 芒果苷在正常組和氧化損傷組INS-1細胞中細胞質(zhì)、細胞核、線粒體的平均藥-時曲線如Fig 2所示。正常組INS-1細胞單次給藥芒果苷100 μmol·L-1后，芒果苷在細胞質(zhì)中濃度快速上升，且明顯高于細胞核和線粒體，達峰后濃度開始下降，4 h達到Cmax，在線粒體的濃度最低，且濃度基本維持不變，在細胞核中達峰較慢，藥時曲線呈持續(xù)上升趨勢；而在模型組中，細胞質(zhì)中濃度上升較快，線粒體的濃度仍然最低，在細胞核中達峰時間提前，約在7 h達到Cmax，隨后濃度下降。

Fig 2 Mean drug concentration-time curves of mangiferin after single administration of 100 μmol·L-1 mangiferin in mitochondria,nuclei and cytosol in normal(CON) and model(MOD) INS-1 cells

3.2.2芒果苷在正常組和模型組INS-1細胞內(nèi)分布的藥動學參數(shù) 正常組和模型組INS-1細胞單次給藥芒果苷單體100 μmol·L-1后，芒果苷在細胞的線粒體、細胞核、細胞質(zhì)內(nèi)的藥代動力學參數(shù)見Tab 2。正常組INS-1細胞單次給藥芒果苷100 μmol·L-1后，芒果苷在細胞內(nèi)分布Cmax和AUC(0-t)從小到大的順序為：線粒體<細胞質(zhì)<細胞核，在模型組細胞順序為： 線粒體<細胞核<細胞質(zhì)，提示在正常組芒果苷主要分布于細胞核，而在模型組主要分布于細胞質(zhì)。

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of mangiferin after administration of mangiferin, Zhimu and Zhimu-Huangbai in INS-1

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of mangiferin in mitochondria,nucleus and cytoplasm of normal and oxidative damage model INS-1

4 討論

本文通過LC-MS/MS考察了配伍黃柏對知母中芒果苷在INS-1細胞的藥代動力學特征的影響。在確定給藥劑量時我們發(fā)現(xiàn)，知母凍干粉在25～2 000 mg·L-1劑量范圍內(nèi)對INS-1細胞均無明顯毒性作用，而藥對凍干粉在2 000 mg·L-1時對細胞產(chǎn)生了明顯的毒性作用，經(jīng)綜合考慮細胞毒性和檢測靈敏度等因素，最終使用500 mg·L-1知母-黃柏藥對進行試驗，其所含芒果苷為7 mg·L-1，以芒果苷7 mg·L-1作為給藥劑量確定芒果苷單體及知母凍干粉的用量。從結果來看，芒果苷單體給藥雖然吸收較快，但濃度較低；知母單獨給藥后，芒果苷在細胞內(nèi)濃度Cmax和AUC(0-t)分別上升了59.22%和46.25%，說明知母中的某些成分促進了芒果苷在INS-1細胞中的吸收。Tian等[11]研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷與知母皂苷B2聯(lián)合給藥和知母湯給藥均可明顯促進芒果苷的吸收，且效果相當，提示知母皂苷B2可能是促進細胞內(nèi)芒果苷含量上升的主要活性成分之一。配伍黃柏后，T1/2沒有顯著性變化，提示知母配伍黃柏后對芒果苷在細胞內(nèi)的消除影響不大，但Cmax和AUC(0-t)較知母組分別上升了17.79%和64.06%，較芒果苷單體組分別上升了87.55%和139.94%，表明黃柏中活性成分在一定程度上促進了INS-1細胞對芒果苷的吸收。黃柏的化學成分復雜多樣[2]，包括酚酸類、黃酮類和生物堿等，其中生物堿是主要有效成分，如小檗堿、藥根堿、木蘭花堿、黃柏堿等。有研究表明[12-13]，小檗堿能明顯提高GK大鼠血漿和肝臟中知母皂苷B2的水平，還能提高木蘭花堿的生物利用度且效果與黃柏水煎液相當。但小檗堿是否能促進芒果苷的吸收尚不清楚，黃柏中能夠明顯升高芒果苷在INS-1細胞中濃度的有效成分尚不明確，值得進一步探討。

芒果苷是知母中重要的降糖活性成分之一，細胞中芒果苷濃度的增加更有利于知母黃柏藥對降糖作用的發(fā)揮。對芒果苷在INS-1細胞內(nèi)的分布研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷在正常INS-1細胞中主要分布于胞核，而在氧化損傷狀態(tài)下較多分布于胞質(zhì)。其在線粒體中也發(fā)生了明顯的改變，在氧化損傷狀態(tài)的INS-1細胞中，線粒體AUC(0-t)、Cmax較正常組分別增加了4.11、8.41倍。推測這些分布變化可能與芒果苷的抗氧化作用有關。胞質(zhì)中存在多種細胞器，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是動物細胞內(nèi)面積最大的細胞器。藥效研究表明，芒果苷通過調(diào)節(jié)AMPK活性來抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress)相關的NLRP3炎性小體在PVAT中的活化，從而改善內(nèi)皮細胞的胰島素抵抗[14]；也可有效抑制高糖誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關的氧化應激，并通過抑制TXNIP/NLRP3炎性小體的激活和恢復線粒體膜電位，減少細胞凋亡來保護細胞[15]；還可以清除線粒體產(chǎn)生的活性氧，恢復線粒體生物能量從而有效保護細胞[7]；增加葡萄糖的氧化，提高ATP的生成和維持線粒體膜電位[16]；提示胞質(zhì)和線粒體是芒果苷發(fā)揮作用的重要部位和靶點。我們的研究表明，當細胞發(fā)生氧化損傷時，芒果苷更大量的進入細胞質(zhì)和線粒體，這也為證實芒果苷的作用部位，解釋芒果苷的作用及機制提供了重要依據(jù)。