優(yōu)降寧與多柔比星協(xié)同抑制小鼠三陰性乳腺癌4T-1細胞的增殖和遷移

任 雪，王世恩,2，汪 湘，陳倩影，張 浩，談恒星，夏 燕，曹春雨

(1.三峽大學醫(yī)學院，腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.甘肅省武威市第二人民醫(yī)院，甘肅 武威 733000；3.湖北民族大學附屬民大醫(yī)院風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

乳腺癌是我國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中三陰性乳腺癌約占乳腺癌發(fā)病總數(shù)的15%-20%，其具有易轉(zhuǎn)移、復發(fā)和死亡率高的特征[1]。三陰性乳腺癌由于低表達或不表達雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體-2，其對內(nèi)分泌治療不敏感，因而缺乏有效的臨床治療手段。因此，探索和發(fā)現(xiàn)針對三陰性乳腺癌的臨床藥物靶點和治療策略具有重要的臨床意義。

賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase1，LSD1)是一種黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性的去甲基化酶，主要催化二甲基化和單甲基化的組蛋白H3K4發(fā)生去甲基化，由此參與染色質(zhì)重塑和基因表達調(diào)控，在胚胎發(fā)育、細胞分化和腫瘤發(fā)生等重要生理病理過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，LSD1異常高表達可促進包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展[2-4]，LSD1的異常高表達一方面促進乳腺癌細胞惡性增殖，另一方面，還以LSD1-Snail蛋白復合物形式在上皮標志物E-cadherin基因啟動子區(qū)發(fā)揮抑制功能，從而沉默其基因轉(zhuǎn)錄，由此導致上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)發(fā)生，促進乳腺癌細胞遷移[5-6]。

既有研究發(fā)現(xiàn)，臨床降血壓藥物優(yōu)降寧(Pargyline)具有單胺氧化酶(MAO)抑制作用，可有效抑制LSD1的酶活性[7-8]，因而已被用于以LSD1為靶點的抗腫瘤研究，有望成為腫瘤表觀遺傳治療領域的潛在抗癌藥物[9]。多柔比星(Doxorubicin，DOX)是臨床一線腫瘤化療藥物，目前被廣泛用于乳腺癌的治療。多柔比星可通過嵌入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而破壞拓撲異構(gòu)酶Ⅱ介導的DNA修復，通過抑制DNA復制誘導細胞凋亡發(fā)生，繼而發(fā)揮抗腫瘤細胞增殖的作用。此外，也有研究報道，多柔比星可以通過非拓撲異構(gòu)酶Ⅱ依賴的機制誘導細胞凋亡[10]。盡管多柔比星具有出色的抗腫瘤活性，但其治療指數(shù)相對較低，并且藥物毒性較大，因此限制了臨床應用。此外，有研究報道，多柔比星能通過激活TGF-β信號通路，誘導三陰性乳腺癌細胞發(fā)生EMT[11]，這可能是多柔比星對三陰性乳腺癌治療指數(shù)低和腫瘤耐藥的重要分子基礎。鑒于LSD1是三陰性乳腺癌細胞發(fā)生EMT的重要誘導因子，本實驗將LSD1抑制劑Pargyline與多柔比星聯(lián)合應用，分析優(yōu)降寧與多柔比星對三陰性乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響；并進一步觀察了Pargyline與多柔比星聯(lián)合應用對4T-1細胞荷瘤小鼠生存期和腫瘤增殖的影響，以期為三陰性乳腺癌的臨床治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞株小鼠乳腺癌4T-1細胞購自中國典藏中心，由腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室傳代并保存。

1.2 實驗動物6周齡雌性BALB/c小鼠24只，體質(zhì)量(18-22) g, 購自三峽大學醫(yī)學部實驗動物中心。在恒溫(21-23) ℃、恒濕( 45%-65% )、各12 h明暗周期的飼養(yǎng)室，每籠飼養(yǎng)4-6只小鼠，用全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食和飲水。許可證號：(SCXK(鄂)2017-0012)。

1.3 試劑Pargyline：購自美國MCE公司(批號：34106)；鹽酸多柔比星：購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；Transwell 24孔8 μm孔徑小室：購自美國Costar公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒：購自上海碧云天生物技術有限公司；RIPA組織/細胞裂解液、30%制膠液、溴酚藍：購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人LSD1抗體、小鼠抗人E-cadherin抗體、兔抗人MMP-9抗體，兔抗人Vimentin抗體：購自美國Abcam公司；兔抗人β-actin抗體、HRP標記山羊抗小鼠二抗/山羊抗兔二抗：購自北京中杉金橋公司。

1.4 儀器Western blot電泳及電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，購自美國Bio-Rad公司；倒置顯微鏡、熒光倒置顯微鏡：購自日本尼康公司；全波長酶標儀：購自美國Thermo Fisher公司；化學發(fā)光成像顯影儀：購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.5 CCK-8法檢測腫瘤細胞增殖常規(guī)培養(yǎng)4T-1細胞，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度，將5×103個細胞以100 μL/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)16 h后換用含終濃度為0、0.25、0.5、1、2.5、5、7.5、10 mmol·L-1Pargyline及含終濃度為0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5 mg·L-1DOX的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個藥物濃度設置3個復孔。每孔按1 ∶10加入CCK-8溶液后于培養(yǎng)箱中孵育4 h；在450 nm波長處用酶標儀檢測96孔培養(yǎng)板的吸光度值(A)，同時設置陰性對照與空白對照組。優(yōu)降寧、多柔比星對4T-1細胞的生長抑制率按如下公式計算：生長抑制率/%=[(A實驗組- A空白組)/(A陰性對照組- A空白組)]×100%。

1.6 CCK-8 法檢測優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)合應用對4T-1細胞增殖的影響按照上述方法操作，分別用含終濃度為0、0.25 mmol·L-1Pargyline+0.05 mg·L-1Dox、0.5 mmol·L-1Pargyline+0.1 mg·L-1Dox、1 mmol·L-1Pargyline+0.25 mg·L-1Dox、2.5 mmol·L-1Pargyline+0.5 mg·L-1Dox、5 mmol·L-1Pargyline+1 mg·L-1Dox、10 mmol·L-1Pargyline+2.5 mg·L-1Dox的培養(yǎng)基處理細胞24 h，在450 nm波長處檢測吸光度值(A)。按照Chou-Talalay中位效應與聯(lián)合指數(shù)模型[12]進行優(yōu)降寧和多柔比星聯(lián)合效應分析，實驗數(shù)據(jù)以CompuSyn 2.0軟件進行藥物聯(lián)合作用分析，兩藥物的聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)<1說明藥物之間存在協(xié)同效應。

1.7 乳酸脫氫酶釋放實驗檢測優(yōu)降寧與多柔比星對4T-1細胞的毒性離心收集4T-1細胞，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×104個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)至至細胞密度為70%左右時，換用含終濃度為 0、0.5、2.5、10 mmol·L-1Pargyline與終濃度為0、0.05、0.1、0.5 mg·L-1DOX的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每個藥物濃度設3個復孔，同時設置無細胞組與陰性對照組。按照試劑盒操作說明書，加入 LDH 檢測工作液60 μL后室溫(25 ℃)避光孵育30 min，于490 nm處測定吸光度(A)。細胞毒性/%=(A藥物處理組-A細胞對照組)/(A細胞最大酶活性組-A細胞對照組)×100。

1.8 劃痕實驗分析優(yōu)降寧與多柔比星對4T-1細胞遷移能力的影響離心收集4T-1細胞，計數(shù)、調(diào)整細胞濃度后將5×104個細胞/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中。常規(guī)培養(yǎng)至貼壁后，用200 μL槍頭在培養(yǎng)板底部劃“十”字形劃痕并以PBS洗滌細胞2次后換用上述濃度藥物處理24 h，同時設置陰性對照組。分別在藥物處理后0 h、6 h、12 h時用倒置熒光顯微鏡觀察取圖；用ImageJ軟件計算劃痕面積(S)，分析藥物對4T-1細胞遷移能力的影響。

1.9 Transwell實驗分析優(yōu)降寧與多柔比星對4T-1細胞遷移能力的影響按照上述細胞培養(yǎng)方法，以藥物處理4T-1細胞24 h，并設置陰性對照組。收集上述細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸洗滌2次。計數(shù)后，調(diào)整細胞密度為2.5×105個細胞/mL。向24孔細胞培養(yǎng)板中加入1 mL RPMI 1640培養(yǎng)基(10% FBS)，將Transwell小室置于培養(yǎng)孔中，向小室內(nèi)垂直加入200 μL細胞懸液(5×104個細胞/小室)、于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h。取出Transwell小室，吸棄培養(yǎng)基，PBS潤洗3次后，加入600 μL結(jié)晶紫-甲醇溶液染色15 min。PBS潤洗3次后，用濕棉簽拭去小室底部內(nèi)側(cè)面的細胞，然后置于載玻片上，使用倒置顯微鏡觀察并取圖。最后將小室置于避光處自然風干，以600 μL結(jié)晶紫溶劑(0.1 mol·L-1的枸櫞酸鈉50%乙醇溶液)溶解，使用酶標儀于540 nm波長檢測OD值，由此對遷移細胞進行定量分析。

1.10 Transwell實驗分析優(yōu)降寧與多柔比星對4T-1細胞侵襲能力的影響取Transwell小室于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，將Matrigel以1 ∶8比例用無血清培養(yǎng)基稀釋后，按每小室50 μL加入并于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜(約12 h)使其充分凝固。然后按前述方法加入Pargyline、Dox處理后的4T-1細胞，常規(guī)細胞培養(yǎng)24 h。最后，按前述方法以結(jié)晶紫染色、倒置熒光顯微鏡拍照取圖；再加入結(jié)晶紫溶劑溶解后，用酶標儀于540 nm處檢測其OD值，由此對侵襲細胞進行定量分析。

1.11 Western blot檢測細胞EMT相關蛋白的表達水平RIPA裂解液提取各組藥物處理24 h的4T-1細胞中的總蛋白并制備蛋白樣后，以8% SDS-PAGE電泳，然后以電泳轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜后加入1% BSA稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜。然后以TBST洗膜，重復3次；再加入相應二抗于搖床上室溫孵育1 h。TBST洗膜3次后加入ECL顯影液，使用化學發(fā)光成像顯影儀顯影。最后用ImageJ分析目的蛋白條帶的灰度值，目的蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/對應內(nèi)參條帶灰度值。

1.12 荷瘤小鼠模型驗證優(yōu)降寧與多柔比星對4T-1移植瘤的影響將4T-1細胞接種于24只5-6周齡雌性Balb/c小鼠腹部脂肪墊(5×105個/只)。4 d后觀察成瘤，以隨機分組法將小鼠分為4個組：Control組、Doxorubicin組、Pargyline組和Pargyline+Doxorubicin聯(lián)合組，每組6只。腫瘤體積為10-20 mm3時腹腔給藥：Pargyline 5 mg·kg-1[13]，Doxorubicin 0.5 mg·kg-1[14]；每連續(xù)給藥3 d停藥1 d，持續(xù)3周。每隔兩天測量一次腫瘤長徑a和短徑b，并記錄小鼠體重；最后根據(jù)公式V=ab2/2計算腫瘤體積。用藥結(jié)束后，以CO2吸入法處死各組小鼠，取出腫瘤后稱重、拍照，同時取小鼠心肝腎以4%多聚甲醛固定、70%乙醇處理并脫水后，石蠟包埋、切片進行H&E染色。

1.13 數(shù)據(jù)分析運用ImageJ、Graphpad Prism 8.0等軟件進行灰度掃描、繪圖及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)降寧與多柔比星明顯抑制4T-1細胞增殖CCK-8法檢測梯度濃度的優(yōu)降寧、多柔比星處理后4T-1細胞的增殖水平，結(jié)果顯示，優(yōu)降寧與多柔比星均能有效抑制4T-1細胞的增殖，且抑制率均呈藥物濃度依賴性增高(Fig 1A)。乳酸脫氫酶釋放實驗檢測結(jié)果表明，當優(yōu)降寧與多柔比星的濃度分別等于或低于2.5 mmol·L-1和0.1 mg·L-1時，對4T-1細胞無明顯細胞毒性(P<0.05)(Fig 1B)。由于此濃度優(yōu)降寧與多柔比星均可有效抑制4T-1細胞增殖，故使用2.5 mmol·L-1Pargyline和0.1 mg·L-1Doxorubicin用于后續(xù)實驗。

2.2 優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)合應用對4T-1細胞的增殖具有協(xié)同抑制效應為分析優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)合使用對4T-1細胞增殖的影響，本研究中我們使用Chou-Talalay方法計算聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)值來評估兩藥之間的藥物協(xié)同作用。實驗數(shù)據(jù)分析表明，兩種藥物聯(lián)合應用能有效地抑制4T-1細胞生長，二者之間的聯(lián)合指數(shù)(CI)<1，顯示出藥物協(xié)同抑制效應(Fig 2)。

2.3 優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)合應用明顯抑制4T-1細胞遷移細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，優(yōu)降寧能有效抑制4T-1細胞的遷移，但0.1 mg·L-1多柔比星無此影響，而兩藥聯(lián)用對4T-1細胞遷移的抑制作用比單用優(yōu)降寧更為明顯(Fig 3)；類似地，Transwell遷移實驗結(jié)果也證實，單獨使用2.5 mmol·L-1Pargyline處理4T-1細胞可抑制其遷移能力，而0.1 mg·L-1Doxorubicin則對4T-1細胞的遷移能力具有促進作用。與單用優(yōu)降寧相比，兩藥聯(lián)用能更有效地抑制4T-1細胞遷移(Fig 4)。

2.4 優(yōu)降寧與多柔比星合應用明顯抑制4T-1細胞侵襲在前述遷移實驗的基礎上，進一步使用Transwell侵襲實驗分析了優(yōu)降寧與多柔比星單獨或聯(lián)合應用對4T-1細胞的侵襲能力的影響。實驗結(jié)果顯示，0.1 mg·L-1Doxorubicin能明顯促進4T-1細胞的侵襲，2.5 mmol·L-1優(yōu)降寧單獨或與0.1 mg·L-1Doxorubicin 聯(lián)合應用均可明顯抑制4T-1細胞的侵襲(Fig 5)。

2.5 優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)用可抑制4T-1細胞EMT利用Western blot方法檢測了優(yōu)降寧與多柔比星對4T-1細胞中EMT相關標志分子表達水平的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，多柔比星對上皮細胞標志分子E-cadherin和間質(zhì)細胞標志分子MMP-9和Vimentin的表達水平無明顯影響，而單用優(yōu)降寧可明顯上調(diào)E-cadherin表達并下調(diào)MMP-9和Vimentin的表達水平，二者聯(lián)合應用時，趨勢更為明顯(Fig 6)。

Fig 1 Effects of pargyline and doxorubicin on proliferation and cytotoxicity of 4T-1 cells(100×)4T-1 cells were respectively treated with different concentrations of pargyline (0,0.25,0.5,1.0,2.5,5.0,7.5,10.0 mmol·L-1) and doxorubicin (0,0.05,0.1,0.25,0.5,1.0,2.5,5.0 mg·L-1) for 24 h. The inhibitory rate (A) and cytotoxicity (B) were respectively detected by CCK-8 method and LDH **P<0.01 vs control.

Fig 2 Analysis of combined use of pargyline and doxorubicinA: The CI values of pargyline and doxorubicin at ED50,ED75,ED90; B: Distribution of CI values of pargyline combined with doxorubicin; C. Analysis of the synergistic effect of pargyline and doxorubicin in inhibiting the proliferation of 4T-1 cells.

2.6 優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)用能更有效抑制4T-1移植瘤在小鼠體內(nèi)增殖荷瘤小鼠模型驗證優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)合應用對4T-1移植瘤的影響。結(jié)果顯示，優(yōu)降寧對4T-1移植瘤的生長無明顯影響，多柔比星雖有抑制瘤體生長的趨勢，但未達明顯性水平，而上述兩藥聯(lián)合應用則能有效抑制4T-1移植瘤的生長(Fig 7A-C)，與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。與此類似，僅兩藥聯(lián)合應用能明顯延長荷瘤小鼠的生存期(Fig 7D)。此外，二種藥物單用或聯(lián)用對小鼠的體重均無明顯影響(Fig 7E)；也未對荷瘤小鼠心、肝、腎產(chǎn)生明顯的藥物毒性(Fig 7F)。

Fig 6 Effects of pargyline and doxorubicin on expression of EMT-related proteins in 4T-1 1:Control;2：Dox 0.1 mg·L-1;3:Pargyline 2.5 mmol·L-1;4:Dox 0.1 mg·L-1+Pargyline 2.5 mmol·L-1. *P<0.05，**P<0.01 vs control.

Fig 5 Effects of pargyline and doxorubicin on invasion ability of 4T-1 cells with Transwell Transwell assay (A) was implemented to resolve the invasion ability of 4T-1 cells,treated respectively with pargyline 2.5 mmol·L-1,doxrubicin 0.1 mg·L-1,doxrubicin 0.1 mg·L-1+pargyline 2.5 mmol·L-1 for 7 h(×100). The number of invaded cells was shown in quantized graph (B).1:Control;2：Dox 0.1 mg·L-1;3:Pargyline 2.5 mmol·L-1;4:Dox 0.1 mg·L-1+Pargyline 2.5 mmol·L-1.**P<0.01 vs control.

Fig 4 Effects of pargyline and doxorubicin on migration ability of 4T-1 cells with Transwell Transwell assay (A) was carried out to investigate the migration ability of 4T-1 cells,treated respectively with pargyline 2.5 mmol·L-1,doxrubicin 0.1 mg·L-1,doxrubicin 0.1 mg·L-1+pargyline 2.5 mmol·L-1 for 7 h(×100). The number of migrated cells were shown in quantized graph (B).1:Control;2：Dox 0.1 mg·L-1;3:Pargyline 2.5 mmol·L-1;4:Dox 0.1 mg·L-1+Pargyline 2.5 mmol·L-1. t-test,**P<0.01 vs control.

Fig 3 Effects of pargyline and doxorubicin on migration ability of 4T-1 cells analyzed by scratch test(100×)4T-1 cells were treated with pargyline 2.5 mmol·L-1,doxrubicin 0.1 mg·L-1,doxrubicin 0.1 mg·L-1+pargyline 2.5 mmol·L-1 for 0,6,and 12 h,respectively. Scratch experiment was performed to analyze the effect on migration ability of 4T-1 cells.

3 討論

EMT是被定義為丟失上皮特性的一種細胞重編程過程，包括細胞間粘附和上皮細胞標志物的表達，以及更具遷移性的間充質(zhì)表型的獲得[15]。研究表明， EMT有促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲的作用[16]。Snail通過募集LSD1并結(jié)合相關上皮粘附分子的基因啟動子區(qū)，由LSD1催化其組蛋白H3K4me1/2去甲基化，可抑制相關基因表達[17]。這一機制在乳腺癌細胞發(fā)生上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中也發(fā)揮重要作用，導致乳腺癌細胞遷移和轉(zhuǎn)移增加[5-6]。同時，有研究表明，作為治療乳腺癌的一線化療藥物多柔比星(Doxorubicin)，可通過促進癌細胞發(fā)生EMT，而促進包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移[18-19]，這可能是多柔比星對三陰性乳腺癌治療指數(shù)低和腫瘤耐藥的重要分子基礎?；谏鲜霰尘?，本實驗將LSD1抑制劑優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)合應用，在細胞和實驗動物的水平上，分析了優(yōu)降寧和多柔比星聯(lián)合應用對三陰性乳腺癌細胞增殖，侵襲和遷移的影響。結(jié)果顯示，優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)合應用能夠產(chǎn)生藥物協(xié)同作用抑制4T-1細胞增殖。重要的是，低濃度多柔比星能夠促進4T-1細胞的遷移和侵襲，而優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)合應用可明顯抑制4T-1細胞的遷移和侵襲。其中優(yōu)降寧處理導致上皮細胞標志分子E-cadherin表達上調(diào)、EMT相關蛋白MMP-9和Vimentin表達下調(diào)，這可能是其抑制4T-1 細胞遷移侵襲能力的分子基礎。在荷瘤小鼠模型中，單獨使用優(yōu)降寧或低劑量多柔比星不能明顯抑制4T-1移植瘤的生長和影響小鼠生存期。但優(yōu)降寧與低劑量多柔比星聯(lián)合應用能夠明顯抑制4T-1移植瘤的生長和延長小鼠生存期，這一結(jié)果提示優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)合應用產(chǎn)生的藥物協(xié)同作用和對LSD1活性的抑制作用具有重要的意義，即：

一方面降低多柔比星有效劑量可使其藥物毒副作用減小，另一方面有效地抑制多柔比星的促EMT作用，由此抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移。此外，Pargyline(優(yōu)降寧)作為臨床已經(jīng)應用的藥物，有利于快速推進以LSD1為靶點的抗腫瘤治療研究及其應用。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果為三陰性乳腺癌的臨床治療提供了新思路，提示優(yōu)降寧與多柔比星聯(lián)合用藥在乳腺癌臨床治療中具有潛在應用價值。