Nampt對(duì)ERK1/2的調(diào)控在病理性心肌肥大中的作用研究

陳建杏，王盼霞，胡粵懷，路 靜，劉培慶

(中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

病理性心肌肥大是心臟在應(yīng)對(duì)各種病理刺激時(shí)表現(xiàn)出的適應(yīng)性反應(yīng)，整體主要表現(xiàn)為心臟增大、心腔縮小、心室壁增厚。心肌細(xì)胞典型肥大特征包括：胚胎基因重新激活和心肌細(xì)胞表面積增大。病理性心肌肥大開(kāi)始是代償性的增大，但持續(xù)發(fā)展到不可逆轉(zhuǎn)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心功能下降，甚至心力衰竭[1-2]。心肌肥大的發(fā)病機(jī)制尤為復(fù)雜，因此，深入研究其病理機(jī)制及關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在病程初期進(jìn)行有效干預(yù)，可延緩心衰進(jìn)程，為其防治提供重要的理論依據(jù)。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)，屬于促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員，其磷酸化與病理性心肌肥大有關(guān)。在受到胞外肥大信號(hào)刺激時(shí)，心肌細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體激活，進(jìn)而激活了RAS-RAF-MEK-ERK1/2 級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)，使得ERK1/2發(fā)生磷酸化轉(zhuǎn)位入核，從而增加肥厚相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[3]。有研究表明，G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)10可抑制ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)，從而減輕心肌肥大[4]。因此，抑制ERK1/2的異常激活可減緩心肌肥大發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine denucleotide，NAD)是傳遞氫離子的輔酶，能接受氫化物，形成還原型NADH，為線粒體電子傳遞鏈提供還原等價(jià)物，從而參與線粒體三羧酸循環(huán)。煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，Nampt)，長(zhǎng)度約52 ku，結(jié)構(gòu)高度保守，在心臟中含量豐富[5]。在哺乳動(dòng)物中，Nampt主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)以煙酰胺(NAM)為原料合成的NAD+補(bǔ)救生物合成途徑，且是NAD+合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶[6]。研究表明，Nampt可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受PARP1誘導(dǎo)的凋亡損傷[7]，其競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑FK866可導(dǎo)致線粒體功能障礙[8]。NAD+可作為Ⅲ類(lèi)去乙?；?Sirtuins)和PARPs等多種調(diào)節(jié)蛋白家族的底物，調(diào)控基因表達(dá)、DNA修復(fù)、凋亡、線粒體生物合成及蛋白折疊反應(yīng)等。研究表明，Nampt可能對(duì)心臟具有保護(hù)作用，但Nampt是否參與了ERK1/2調(diào)控的病理性心肌肥大，尚未見(jiàn)明確報(bào)道。

基于以上研究背景，本文探究了Nampt對(duì)ERK1/2的調(diào)控作用及與病理性心肌肥大的關(guān)系，為心肌保護(hù)新靶點(diǎn)的尋找提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑PE粉末(純度>99%，英國(guó)，Bristol)；ISO粉末(純度>99%，美國(guó)，Sigma，I5627-5G)；組織用胰酶粉末(美國(guó)，Sigma，B5002-250 mg)；細(xì)胞用血清(美國(guó)，Gibco，10099-141)；Nampt抗體(66385-1-Ig-100 uL)和GAPDH抗體(10494-1-AP)，品牌均為美國(guó)Proteintech；ERK1/2抗體(9102S)、p-ERK1/2抗體(5726S)、Lamin B1抗體(68591S)、兔二抗(8889S)和鼠二抗(4410S)，品牌均為美國(guó)CST；ANF抗體(美國(guó)，Santa Cruz，sc-515701)；BNP抗體(美國(guó)，Millipore)；α-Tubulin抗體(美國(guó)，Sigma,T8328-200 UL)；核蛋白提取試劑盒(美國(guó)，Active Motiff，40010)；BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)，Thermo，23227)；TRIzol(日本，TaKaRa)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo，K1622)；NAD+/NADH測(cè)定試劑盒(英國(guó)，Abcam，ab65348)。

1.2 儀器細(xì)胞用CO2培養(yǎng)箱、全自動(dòng)高內(nèi)涵篩選分析系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均購(gòu)于美國(guó)Thermo；單人單面超凈工作臺(tái)購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)蘇州；恒溫水浴鍋來(lái)自德國(guó)Memmert；顯微成像系統(tǒng)使用的是美國(guó)Invitrogen品牌；移液槍、冷凍高速離心機(jī)和常溫低速離心機(jī)則出自德國(guó)Eppendorf；蛋白電泳儀和蛋白電轉(zhuǎn)儀均購(gòu)于美國(guó)BioRad；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)是美國(guó)Waukesha品牌的產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 用酒精棉擦拭SD大鼠乳鼠(1-3 d)胸腹部表面，開(kāi)胸并小心分離出心臟，修剪干凈后心臟對(duì)稱(chēng)剪碎4-6塊至均勻大小，轉(zhuǎn)至提前高壓滅菌錐形瓶。加入適量0.8 g·L-1的胰酶，冷消化20 min。中途輕輕晃動(dòng)瓶子，使冷消充分。然后在磁力攪拌器37 ℃水浴攪拌消化，每次5 min。小心吸取上清至新的15 mL離心管，加含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。錐形瓶另加胰酶繼續(xù)消化至完全。重懸離心收集到的細(xì)胞，種植在150 mm的大皿(按10-14只乳鼠的量計(jì)算)，將培養(yǎng)皿置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h，然后收集上層培養(yǎng)基。以一定密度將細(xì)胞均勻種在細(xì)胞培養(yǎng)皿/孔板中，并加入雙抗和5-溴脫氧尿嘧啶核苷。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待心肌細(xì)胞貼壁后換液，并按實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行不同處理。

1.3.2RT-qPCR 用TRIzol將細(xì)胞輕柔吹下并收集，加入氯仿，迅速上下顛倒幾次至液體明顯乳化分層，使蛋白質(zhì)變性，并除去一些脂溶性雜質(zhì)。靜置離心后小心吸取上層透明水相至新的EP管中，加預(yù)冷異丙醇混勻，靜置，離心，使RNA沉淀在EP管底部析出。沉淀中加體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗滌，離心后直接倒去上清，于紙巾上倒扣去除殘液，或用小槍頭進(jìn)一步去除管壁殘液，然后置通風(fēng)櫥中室溫干燥。之后用適量DEPC水作為溶劑，于58 ℃水浴或空氣浴輔助溶解RNA，然后用nanodrop測(cè)定其濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄第一步體系為12 μL，PCR條件是：65 ℃，5 min，然后降溫至4 ℃；第二步是基于第一步反應(yīng)，總體系20 μL。PCR條件為：先42 ℃持續(xù)60 min，然后70 ℃反應(yīng)5 min，最后降溫至4 ℃。

1.3.3Western blot 原代心肌細(xì)胞經(jīng)貼壁、換液、加藥處理、繼續(xù)培養(yǎng)完成后加適量RIPA裂解液，將細(xì)胞全部刮下于冰上孵育30 min，使細(xì)胞充分裂解，蛋白質(zhì)釋放出來(lái)。心臟組織經(jīng)稱(chēng)重、洗滌、剪碎、離心等步驟，加入適量RIPA重懸，充分勻漿。得到的細(xì)胞/組織蛋白裂解液離心15 min(4 ℃、12 000×g)，去除細(xì)胞碎片或組織不容物。取上清液5 μL和PBS溶液20 μL進(jìn)行吸光度的測(cè)定。計(jì)算濃度并制樣。用SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行蛋白樣品電泳分離，經(jīng)電泳，電轉(zhuǎn)，封閉，一抗孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育并洗滌后，將切下的蛋白膜條帶和顯色液反應(yīng)，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影檢測(cè)。

1.3.4心肌肥大和心衰動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物SPF 級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠均購(gòu)買(mǎi)并飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量約為200 g，其質(zhì)量合格編號(hào)：4400850000012196[9]。所有的實(shí)驗(yàn)操作均在動(dòng)物中心實(shí)施完成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為異丙腎上腺素(ISO)給藥模型和腹主動(dòng)脈縮窄(AAC)模型。

ISO誘導(dǎo)的模型組(雌雄不限，n=12)大鼠每天接受皮下注射ISO溶液(2.5 mg·kg-1)，對(duì)照組則給予等體積量生理鹽水。連續(xù)給藥1周或3周。AAC模型(雄性，n = 10)的SD大鼠則經(jīng)歷了術(shù)前麻醉、術(shù)中迅速開(kāi)腹、鈍性分離腎動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈，并用5/0絲線結(jié)扎腹主動(dòng)脈，以及術(shù)后進(jìn)行傷口縫合等過(guò)程。Sham組大鼠也進(jìn)行了開(kāi)腹手術(shù)但不束縛主動(dòng)脈。所有動(dòng)物于給藥前后進(jìn)行超聲心動(dòng)檢測(cè)。AAC術(shù)后8周取材。

1.3.5細(xì)胞水平干預(yù)Nampt (1)過(guò)表達(dá)Nampt：用載體為pcDNA 3.1(+)，攜帶大鼠Nampt編碼區(qū)的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞48 h，只轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1(+)質(zhì)粒作為對(duì)照組。

(2)敲低Nampt：加入Nampt干擾序列降低其表達(dá)或加入抑制劑FK866抑制其酶活性。對(duì)幾種siRNA進(jìn)行篩選，選定敲低效率較高的siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RNA干擾采用Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4-6 h換液，換成無(wú)血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞增殖減緩，提高干擾效率。此外，我們也通過(guò)加入FK866來(lái)模擬Nampt敲低的效果。加入5 μmol·L-1FK866，與原代心肌細(xì)胞共同孵育24 h，然后提取蛋白或RNA。

1.3.6核蛋白提取 以150 mm大皿為例：開(kāi)始收集細(xì)胞離心用500×g，其余均為14 000×g。

原代心肌細(xì)胞經(jīng)貼壁、換液、加藥處理、繼續(xù)培養(yǎng)完成后用預(yù)冷PBS/PI洗滌并刮下，離心后用1×Hypotonic Buffer重懸并于冰上孵育15 min。孵育完成后以最大轉(zhuǎn)速渦旋10 s，并用胰島素針輕輕勻漿。短暫離心，上清即為胞質(zhì)蛋白。用1×Hypotonic Buffer 清洗沉淀1次后加入Complete Lysis Buffer重懸，在搖床上搖擺孵育30 min。離心后的上清即為核蛋白?？捎每捡R斯亮藍(lán)和BCA定量法分別對(duì)核蛋白、胞質(zhì)蛋白進(jìn)行定量并制樣。

1.3.7原代心肌細(xì)胞表面積測(cè)定 每次進(jìn)行下一步操作處理前均先用37 ℃的PBS清洗3次。

(1)固定細(xì)胞：細(xì)胞處理完成經(jīng)洗滌后，加入提前放至室溫的4%多聚甲醛固定，以15-20 min為宜。

(2)透膜：棄去多聚甲醛，室溫下開(kāi)蓋干燥5 min，去除殘余多聚甲醛。加入體積分?jǐn)?shù)為0.3%的Triton破膜10 min。

(3)細(xì)胞染色：加入羅丹明-鬼筆環(huán)肽于37 ℃避光孵育半小時(shí)，然后用DAPI染核5 min，最后用高內(nèi)涵系統(tǒng)測(cè)定總體細(xì)胞表面積。

1.3.8SD大鼠心臟取材 用戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)麻醉大鼠后迅速開(kāi)胸，小心將心臟周?chē)慕M織血管等分離干凈，然后從心尖處灌注氯化鉀(0.1 mol·L-1)溶液至心臟停博。取出心臟，擠去殘血并將結(jié)締組織等修剪干凈，但保留完整心耳。心臟進(jìn)行稱(chēng)重并拍照，然后沿最大橫截面分切，上半部分浸泡在多聚甲醛進(jìn)行后續(xù)切片，下半部分凍存于-80 ℃冰箱或液氮中。處死后的大鼠丈量脛骨長(zhǎng)后置放于黃色醫(yī)療袋，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后放置中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物尸體房進(jìn)行統(tǒng)一無(wú)害化處理。

2 結(jié)果

2.1 建立PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型及Nampt的表達(dá)變化首先使用PE(100 μmol·L-1)構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型。如Figure 1A-B所示，PE處理后的心肌細(xì)胞表面積明顯大于對(duì)照組(Figure 1A)，且心肌肥大相關(guān)指標(biāo)ANF、BNP和β-MHC的mRNA表達(dá)也呈現(xiàn)明顯上調(diào)的趨勢(shì)(Figure 1B)，提示成功構(gòu)建PE誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞肥大模型。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NAD+的變化，發(fā)現(xiàn)PE可時(shí)間依賴(lài)性地降低NAD+的含量(Figure 1C)。隨后，我們考察了此模型下調(diào)控NAD+水平的關(guān)鍵蛋白Nampt的RNA和蛋白表達(dá)變化。如Figure 1D所示，與對(duì)照組相比，給予PE刺激12 h，Nampt的mRNA水平呈升高趨勢(shì)。進(jìn)一步檢測(cè)Nampt的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)給予PE不同時(shí)間點(diǎn)處理，Nampt的蛋白表達(dá)升高，且呈時(shí)間依賴(lài)性(Figure 1E)。

2.2 大鼠心肌肥大及心衰模型的建立及Nampt的表達(dá)變化為了在動(dòng)物水平進(jìn)一步驗(yàn)證Nampt的表達(dá)變化，分別構(gòu)建了AAC及ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌肥大和心衰模型。與對(duì)照組相比，AAC組或者ISO處理后，大鼠心臟體積明顯增大、心肌細(xì)胞體積增大、排列紊亂(Figure 2A-D)。分別提取心臟組織mRNA和蛋白，檢測(cè)Nampt的表達(dá)變化。如Figure 2E-F所示，RT-qPCR和 Western blot結(jié)果顯示：與Sham組比，AAC組Nampt的mRNA及蛋白水平均明顯升高。在ISO處理下，與對(duì)照組相比，無(wú)論是肥大還是衰竭的心臟中，Nampt的mRNA及蛋白水平均明顯升高，且隨病理模型的嚴(yán)重程度而越明顯(Fugure 2G - H)。以上研究結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，心肌肥大刺激能明顯升高Nampt的表達(dá)，提示Nampt可能是重要的心肌肥大調(diào)控因子。

2.3 Nampt對(duì)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響為了探究Nampt在PE誘導(dǎo)的心肌肥大的作用，分別采用功能獲得和缺失的手段干預(yù)其表達(dá)。首先在原代心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染載體為pcDNA 3.1(+)并攜帶大鼠Nampt編碼區(qū)的質(zhì)粒以過(guò)表達(dá)Nampt，并檢測(cè)心肌肥大指標(biāo)的變化情況。Figure 3A的結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，PE處理組胚胎基因ANF和BNP 的蛋白表達(dá)明顯增加，而過(guò)表達(dá)Nampt能明顯抑制PE誘導(dǎo)的胚胎基因的蛋白表達(dá)升高。利用RNA干擾序列敲低心肌細(xì)胞中Nampt的表達(dá)。根據(jù)RT - qPCR和 Western blot結(jié)果(Figure 3B - C)，第3和第4條干擾序列均能有效地降低Nampt的表達(dá)，故選用這兩條siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比，單獨(dú)敲低Nampt可升高胚胎基因ANF和BNP的mRNA水平(Figure 3D)。加入FK866抑制Nampt酶活性之后，其結(jié)果與敲低Nampt類(lèi)似(Figure 3E)。以上結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)Nampt在一定程度上可緩解由PE誘導(dǎo)的心肌肥大作用，Nampt是心肌肥大的負(fù)性調(diào)控因子。

2.4 Nampt對(duì)NAD+含量和ERK1/2 的調(diào)控作用為了進(jìn)一步探討Nampt發(fā)揮心肌保護(hù)作用的具體機(jī)制，通過(guò)采用功能獲得和缺失的手段干預(yù)其表達(dá)，考察細(xì)胞內(nèi)NAD+含量和ERK1/2的變化。結(jié)果顯示，單獨(dú)過(guò)表達(dá)Nampt會(huì)升高胞內(nèi)NAD+的水平，但這一效應(yīng)可被FK866逆轉(zhuǎn)(Figure 4A)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PE刺激原代心肌細(xì)胞后明顯降低細(xì)胞內(nèi)NAD+含量，而這一效應(yīng)可被過(guò)表達(dá)Nampt逆轉(zhuǎn)(Figure 4B)。使用siRNA敲低Nampt或單獨(dú)抑制其酶活性，均能明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)NAD+的水平(Figure 4C，D)。這些結(jié)果提示，Nampt可以酶活性依賴(lài)性地調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)NAD+水平，抑制PE誘導(dǎo)的心肌肥大反應(yīng)。以往報(bào)道顯示，ERK1/2在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌肥大中發(fā)揮了重要作用[10]。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PE處理后能明顯增加ERK1/2的磷酸化水平，而過(guò)表達(dá)Nampt明顯抑制了PE引起的ERK1/2的激活(Figure 4E)。敲低或抑制Nampt則可明顯地誘導(dǎo)ERK1/2的激活(Figure 4E，F(xiàn))。以上結(jié)果提示，Nampt通過(guò)增加心肌細(xì)胞內(nèi)NAD+的含量及抑制ERK1/2的磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮抵抗心肌肥大的作用。

Fig 4 Effects of Nampt on NAD+ level and extracellular regulated protein kinases (ERK1/2) phosphorylation on PE-induced cardiomyocyte hypertrophy in NRCMsNRCMs were transfected with Nampt plasmid or siRNA,and co-incubated with PE (100 μmol·L-1) for 12 h (for mRNA extraction) or 24 h (for protein extraction); FK866 (5 μmol·L-1,24 h) was used to inhibit the enzyme activity of Nampt. (A,B,C and D) The NAD+ level was determined by NAD/NADH Assay Kit (colorimetric assay). (E and F) The protein expression levels of ERK1/2 including t-ERK1/2,p-ERK1/2,were determined by Western blot. *P<0.05 vs pcDNA 3.1 group or Control group;#P<0.05 vs pcDNA3.1+PE group,n=3.

Fig 3 Nampt alleviated phenylephrine (PE)-induced cardiomyocyte hypertrophy in NRCMsNRCMs were transfected with Nampt plasmid or siRNA,and co-incubated with PE (100 μmol·L-1) for 12 h (for mRNA extraction) or 24 h (for protein extraction); FK866 (5 μmol·L-1,24 h) was used to inhibit the enzyme activity of Nampt. (A) Western blot analysis was conducted to show the total protein expression of ANF and BNP simultaneously. (B) RT-qPCR was used to detect the mRNA of Namptin in transcriptional level. (C) Western blot analysis was applied to present the protein changes of Nampt. (D and E) RT-qPCR was used to observe the mRNA levels of ANF and BNP. *P<0.05 vs pcDNA 3.1 group,#P<0.05 vs pcDNA 3.1+PE group,n=3.

Fig 1 Changes of nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) expression in phenylephrine (PE) -induced cardiomyocyte hypertrophy in primary neonatal rat cardiomyocytes(NRCMs)NRCMs were incubated with PE (100 μmol·L-1) for the indicated time point. A: The cell surface area was measured by high content screening analysis. Scale bar:100 μm; B: The mRNA levels of hypertrophic biomarkers including ANF,BNP and β-MHC,were determined by RT-qPCR; C: The nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) level was determined by NAD+/NADH Assay Kit; D: RT-qPCR was used to determine the mRNA transcriptional level of Nampt; E: Western blot was conducted to detect the protein level of Nampt. *P<0.05, **P<0.01 vs control group (n=3).

Fig 2 Changes of Nampt expression in cardiac hypertrophy caused by isopropylarterenol (ISO) and abdominal aortic constriction (AAC)Sprague-Dawley (SD) rats were intraperitoneally injected with ISO (2.5 mg·kg·d-1) for 1 or 3 weeks,or SD rats were subjected to AAC for 8 weeks. (A and C) Representative images of gross heart were shown. (B and D) Representative hematoxylin-eosin (HE) staining images of heart tissues were shown. Scale bar:50 μm. (E) The mRNA level of Nampt was detected by RT-qPCR in AAC-induced cardiac hypertrophy. (F) The protein changes of Nampt was measured by Western blot in AAC-induced cardiac hypertrophy. (G) The mRNA level of Nampt was detected by RT-qPCR in ISO-induced cardiac hypertrophy and heart failure. (H) The protein changes of Nampt were observed by Western blot in ISO-induced cardiac hypertrophy and heart failure. *P<0.05 vs control group,n=3.

3 討論

心肌肥大通常最終會(huì)導(dǎo)致心力衰竭，目前其發(fā)病率及致死率仍是導(dǎo)致臨床死亡的主要病因。因此，維持心臟功能處于代償期及以前，使其免于發(fā)展為心力衰竭，可有效降低心血管疾病的死亡率。然而，病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展過(guò)程極其復(fù)雜，涉及的信號(hào)通路和理化因子等仍需要進(jìn)一步研究闡明[1]。研究表明，心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，線粒體內(nèi)活性氧的升高會(huì)影響電子呼吸傳遞鏈，損害線粒體氧化磷酸化功能，進(jìn)而導(dǎo)致一系列肥厚相關(guān)信號(hào)通路的改變，使心臟出現(xiàn)病理性肥大并引起心肌細(xì)胞凋亡[1,11]。

過(guò)量的兒茶酚胺會(huì)在體內(nèi)和體外引起心肌肥大。而兒茶酚胺類(lèi)主要是作用于腎上腺素能受體，從而參與了對(duì)心臟的調(diào)控作用。研究報(bào)道，心肌細(xì)胞中存在多種腎上腺素能受體，包括α1-腎上腺素能受體(α1A、α1B和α1D)和β-腎上腺素能受體(β1、β2和β3)[12]。PE一方面可以激動(dòng)α1腎上腺素受體，另一方面是其也具有弱的β受體激動(dòng)作用[13]，所以PE是心肌細(xì)胞良好的肥大刺激劑。而ISO 則通過(guò)非選擇性激動(dòng)β受體，從而達(dá)到刺激心臟的效果。因此，我們分別選用PE和ISO作為心肌肥大的誘導(dǎo)劑。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)[14]，采用100 μmol · L-1的PE刺激原代心肌細(xì)胞，成功復(fù)制了PE誘導(dǎo)的心肌肥大模型。分別采用皮下ISO給藥3周及AAC手術(shù)8周的方式，成功建立了SD大鼠心肌肥大和心衰模型。

細(xì)胞內(nèi)NAD+的合成途徑包括從頭合成和補(bǔ)救合成。在原核生物和低等真核生物中，主要有利用喹啉酸經(jīng)從頭途徑和利用煙酸經(jīng)補(bǔ)救途徑合成NAD+兩種方式；在哺乳動(dòng)物中，則主要是由色氨酸和天冬氨酸通過(guò)從頭途徑合成NAD+[6,15]。研究表明，擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)伴有心衰的患者心臟組織中NAD+水平和NAD+/ NADH比值均降低；在 AngⅡ 引起的高血壓和ISO誘導(dǎo)的心衰模型中，也觀察到NAD+水平的下降。外源添加的NAD+能激活SIRT1，減少心衰患者的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡；能提高心衰患者SIRT3活性，從而改善心臟功能；能激活SIRT7，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性并抑制肥大相關(guān)基因表達(dá)從而抑制心肌肥大[16]。這些表明NAD+在心臟中主要發(fā)揮保護(hù)作用，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是一致的。

Nampt在心臟保護(hù)中發(fā)揮了重要作用。內(nèi)源性Nampt上調(diào)可以保護(hù)心臟免受缺血/再灌注的損傷，Nampt下調(diào)則明顯增加了心肌細(xì)胞的凋亡，其潛在機(jī)制可能是通過(guò)增加細(xì)胞NAD+水平，從而激活與NAD+相關(guān)的蛋白信號(hào)通路[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)心肌肥大刺激下Nampt的表達(dá)增加、NAD+含量降低，過(guò)表達(dá)Nampt一定程度上減輕了PE誘導(dǎo)的心肌肥大；相反地，干擾 Nampt表達(dá)或抑制其酶活性則會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大效應(yīng)。我們猜測(cè)，可能是Nampt酶活性依賴(lài)性地升高心肌細(xì)胞內(nèi)NAD+含量，進(jìn)而發(fā)揮抵抗心肌肥大的作用。

此外，ERK1/2 磷酸化可導(dǎo)致多種信號(hào)通路發(fā)生改變。研究表明，在AngⅡ 誘導(dǎo)的心肌肥大模型中，ERK1/2磷酸化水平明顯升高[10]。而磷酸化的ERK1/2可能激活肥厚相關(guān)信號(hào)通路。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Nampt可以抑制PE誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化水平，而干擾Nampt合成或抑制其酶活性則會(huì)誘導(dǎo)ERK1/2激活。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，胞內(nèi)NAD+可增強(qiáng)SIRT1和SIRT3的去乙?；富钚?。SIRT3可通過(guò)抑制MAPK、ERK1/2和PI3K/Akt通路來(lái)阻斷心肌肥大反應(yīng)[17]；SIRT1可以NAD+依賴(lài)性地抑制與抗氧化損傷相關(guān)的Ras/ERK1/2通路[18]。本研究中，Nampt抑制ERK1/2磷酸化的具體機(jī)制并未詳細(xì)闡明，基于上述研究背景及本實(shí)驗(yàn)室的前期研究基礎(chǔ)，我們猜測(cè)Nampt可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)NAD+含量進(jìn)而改變了SIRTs(特別是SIRT1、SIRT3)的去乙?；富钚裕M(jìn)而間接調(diào)控了ERK1/2的磷酸化水平。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)Nampt通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)NAD+含量及ERK1/2磷酸化水平，有效地抵抗病理性心肌肥大，為病理性心肌肥大的防治提供了科學(xué)的理論依據(jù)。