具棲冬青苷對大鼠急性心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用研究

楊愛萍，張啟春，宋 祎，楊 夢，王君陽，王 暢，胡立宏，王嚇長

(南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥功效物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

急性心肌梗死作為臨床上較常見的急危重癥，是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧引起心肌壞死的一類疾病，具有發(fā)病快，致死致殘率高等特點(diǎn)[1, 2]。隨著溶栓療法以及心外科技術(shù)的進(jìn)步，急性心肌梗死患者的死亡率在逐漸減低，但缺血/再灌注后中斷的血流突然恢復(fù)，隨之產(chǎn)生的一系列如再灌注心律失常、微循環(huán)障礙、心肌頓挫以及部分心肌細(xì)胞損傷進(jìn)行性加重等不良反應(yīng)仍然給患者帶來嚴(yán)重的傷害[3-6]。心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)作為心血管疾病近年來研究的熱點(diǎn)之一，尋找藥物預(yù)處理來對抗MIRI是目前臨床工作中亟待解決的問題。

救必應(yīng)為我國南方常用中藥，始載于《嶺南采藥錄》，為冬青科植物鐵冬青(IlexrotundaThunb.)的干燥樹皮或根皮。早期文獻(xiàn)報(bào)道，救必應(yīng)提取物具有降低血壓，減慢心率，緩解心絞痛，預(yù)防冠心病，抗缺氧，抗心律失常以及抵抗心肌缺血的作用[7-8]。具棲冬青苷(pedunculoside，PE)為救必應(yīng)的活性成分之一[9-10]，結(jié)構(gòu)式見Fig 1，其對MIRI的治療作用目前未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary，LAD)30 min，再灌注24 h的方法建立大鼠MIRI模型，研究具棲冬青苷預(yù)處理對MIRI的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制，為臨床尋找更好的心肌保護(hù)藥物提供參考。

Fig 1 Chemical structure of pedunculoside (PE)

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年SD大鼠，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量(300±30) g，由江蘇省南京市青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001，合格證號(hào)：20180004025638。

1.2 藥物和試劑具棲冬青苷(實(shí)驗(yàn)室自制，純度99.5%，白色粉末，易溶于甲醇和DMSO，可溶于水，常溫保存)；卡托普利片(批號(hào)20180306，中美上海施貴寶制藥有限公司)；酒石酸美托洛爾片(批號(hào)20171208，阿斯利康制藥有限公司)；戊巴比妥鈉(批號(hào)20161202，上海市惠興生化試劑有限公司)；肝素鈉(批號(hào)421F027，南京森貝伽生物科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，批號(hào)20160901，南京森貝伽生物科技有限公司)；伊文思藍(lán)(批號(hào)20170305，南京森貝伽生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MAD)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，CTnI)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，批號(hào)20200801。

陽性對照藥美托洛爾、卡托普利和受試藥物具棲冬青苷均采用0.5%羧甲基纖維素鈉配制的混懸液進(jìn)行灌胃給藥，藥物當(dāng)天配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 主要儀器設(shè)備小動(dòng)物呼吸機(jī)(型號(hào)AE02-ALC-V8S，上海奧爾科特生物科技有限公司)；Power Lab(型號(hào)PL3508B73，上海贊德醫(yī)療器械有限公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào)M200 Pro Nanoquant，上海帝肯貿(mào)易有限公司)；冷凍離心機(jī)(批號(hào)Auegra X30R，Beckman公司)；電子天平(型號(hào)OHAUS，蘇州塞恩斯儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理SD大鼠購入后在室溫23 ℃-26 ℃，相對濕度40%-60%環(huán)境下飼養(yǎng)7 d，期間自由進(jìn)食飲水。術(shù)前選取體質(zhì)量在(300±30) g的大鼠，隨機(jī)分成7組，即假手術(shù)組(Sham)、急性心肌缺血/再灌注損傷模型組(M)、卡托普利組(Capt，12.5 mg·kg-1，陽性藥)、美托洛爾組(MT，15 mg·kg-1，陽性藥)、PE低、中、高劑量組(2.5、5和10 mg)，每組大鼠10只。

2.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽浯笫蠓Q重，用2%戊巴比妥鈉溶液(60 mg·kg-1)行腹腔注射麻醉，觀察大鼠反應(yīng)，待角膜反射、肌張力消失后，置鼠板仰臥位固定。剪去大鼠頸部正中、左前胸的體毛備皮，碘伏消毒。先實(shí)施頸部開口，暴露氣管，于視覺可見下連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)置呼吸頻率為90次/min，潮氣量為3 mL/100 g，觀察2 min。待大鼠呼吸平穩(wěn)后，打開Powerlab，將針式電極固定于大鼠四肢皮下, 以監(jiān)測肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖的變化。并于左胸前第3-4肋間逐層開胸，分離心包，暴露心臟，于肺動(dòng)脈圓錐和左心耳間找到左冠狀動(dòng)脈前降支LAD，用絲線于左心耳下緣2 mm處以活結(jié)結(jié)扎，附帶結(jié)扎自制導(dǎo)管。以Ⅱ?qū)?lián)心電圖采集的圖像中ST段明顯抬高，結(jié)扎點(diǎn)以下部位心肌色澤瞬時(shí)變蒼白，或發(fā)生區(qū)域性心肌運(yùn)動(dòng)障礙，即為LAD結(jié)扎成功的標(biāo)志[11-14]。結(jié)扎30 min后，打開活結(jié)，去掉自制導(dǎo)管，恢復(fù)血液供應(yīng)，實(shí)現(xiàn)血液再灌注。隨后，立即用棉球小心拭去胸腔積水，輕輕調(diào)整心肺正常位置，逐層縫合傷口，縫合時(shí)胸腔預(yù)留自制抽氣導(dǎo)管，待拉緊縫合線關(guān)閉胸腔后，抽氣并拔出導(dǎo)管以恢復(fù)胸腔的負(fù)壓狀態(tài)。整個(gè)再灌注過程持續(xù)24 h，24 h后進(jìn)行各指標(biāo)檢測。假手術(shù)組大鼠同模型組大鼠手術(shù)過程，但僅在LAD下留置絲線，不進(jìn)行結(jié)扎和再灌注手術(shù)。術(shù)后觀察大鼠心電圖，如無心律失常、室顫等異形波形圖，且呼吸平穩(wěn)，可小心去掉呼吸機(jī)，縫合頸部皮膚。將大鼠置寵物電熱毯保暖至麻醉消退意識(shí)恢復(fù)。

2.3 給藥方法大鼠術(shù)前3 d連續(xù)灌胃給藥，每日1次，每次灌胃以當(dāng)天體重計(jì)算，灌胃體積10 mL·kg-1。模型組、假手術(shù)組給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。其余各組分別給予PE低、中、高劑量(2.5、5和10 mg·kg-1)、陽性對照藥卡托普利12.5 mg·kg-1、陽性對照藥美托洛爾15 mg·kg-1。末次給藥2 h后開始急性心肌缺血/再灌注損傷手術(shù)操作。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1Ⅱ?qū)?lián)心電圖 記錄各組大鼠的Ⅱ?qū)?lián)心電圖，觀察缺血性心律失常的發(fā)生，并記錄缺血/再灌注后ST段高度的變化。

2.4.2血流動(dòng)力學(xué) 連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)Power Lab、壓力換能器及聚乙烯導(dǎo)管，用0.1%肝素鈉生理鹽水沖洗并充盈導(dǎo)管，排空氣泡備用。分離大鼠右頸總動(dòng)脈，根據(jù)顯示器所示壓力圖形的變化，將含0.1%肝素鈉的導(dǎo)管緩緩插入左心室，監(jiān)測大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)的變化，評估心臟收縮及舒張功能。觀察指標(biāo)包括左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室等容期壓力最大變化速率(the maximum rate of pressure rise and fall，±dP/dtmax)。

2.4.3心肌梗死面積 待再灌注結(jié)束后，將2 mL 1%伊文思藍(lán)由主動(dòng)脈注入左心室染色，區(qū)分非缺血區(qū)(藍(lán)染區(qū))與缺血區(qū)(非藍(lán)染區(qū))。然后迅速處死大鼠，取出離體心臟，用冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，擠出心臟內(nèi)部液體，濾紙吸干心臟表面水分，稱量心臟重量，用于心臟臟器指數(shù)計(jì)算。置-80 ℃冰箱冷凍10 min后取出，將心臟橫切成2 mm厚的切片，置于1% TTC溶液中，37 ℃恒溫避光染色20 min，區(qū)分缺血未梗死區(qū)(磚紅色)和梗死區(qū)(灰白色)。TTC染色后將心肌切片放入4%的多聚甲醛溶液中固定24 h。心肌切片拍照后，采用電腦圖像分析軟件Image Pro Plus測定心肌梗死面積百分比/%=(心肌梗死區(qū)面積之和/心肌缺血區(qū)面積之和)× 100%。

2.4.4心臟臟器指數(shù) 心臟臟器系數(shù)=(心臟重量/體重)× 100%，體重為末次給藥體重。

2.4.5血清中SOD、MAD、CTnI含量測定 測定血流動(dòng)力學(xué)后，大鼠頸動(dòng)脈取血4 mL，4 ℃靜置1 h，以3 500 r·min-1低溫離心10 min，分裝血清于EP管中，-80 ℃保存。測定時(shí)取出血清，快速解凍，嚴(yán)格按照試劑盒說明，測血清中SOD、MAD和CTnI的含量。

3 結(jié)果

3.1 具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注大鼠心電圖ST段高度的影響SD大鼠在結(jié)扎LAD后，可見S波消失，ST段明顯抬高，經(jīng)血液再灌注24 h后，ST段略降低，但各組間未見顯著性差異，見Fig 2。MIRI模型制備過程中有5只大鼠因心律失常死亡而舍棄，建模成功率大于90%。

Fig 4 TTC staining of myocardial sections in rats

Fig 3 Evens blue staining of whole heart in rats

Fig 2 Changes of electrocardiogram of MIRI model ratsA： Normal electrocardiogram; B： After LAD ligation; C： 24 h after reperfusion

3.2 具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響與假手術(shù)組比較，MIRI組大鼠LVSP和+dP/dtmax下降，LVEDP和-dP/dtmax上升，差異均有顯著性(P<0.01)，說明模型組大鼠心臟舒張功能和收縮功能明顯受損；與模型組比較，卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷中、高劑量組LVSP升高；卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷高劑量組+dP/dtmax升高；卡托普利組、具棲冬青苷高劑量預(yù)處理組LVEDP和-dP/dtmax降低，差異存在顯著性(P<0.05)；提示具棲冬青苷預(yù)處理有改善急性心肌缺血/再灌注損傷后心肌收縮及舒張功能的作用，結(jié)果如Tab 1所示。

Tab 1 Effects of pedunculoside on hemodynamics in MIRI rats

3.3 具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注大鼠心肌梗死面積的影響各組大鼠經(jīng)LAD結(jié)扎30 min，再灌注24 h后，整體心臟用伊文思藍(lán)染色后，除假手術(shù)組外，其他各組大鼠結(jié)扎線以下可見缺血區(qū)(非藍(lán)染區(qū))，其中模型組缺血區(qū)域比較明顯，見Fig 3。心肌切片用TTC染色后，同樣模型組梗死區(qū)(灰白色區(qū))較明顯，見Fig 4。

與假手術(shù)組相比，心肌缺血/再灌注模型組大鼠心肌梗死面積明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷低、中、高劑量組心肌梗死面積明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且具棲冬青苷高劑量組的效果比低劑量的效果更明顯，提示具棲冬青苷預(yù)處理可緩解心肌缺血/再灌注后的心肌梗死，見Fig 5。

Fig 5 Effects of pedunculoside on myocardial infarct size in MIRI rats*P<0.05，**P<0.01 vs MIRI Model; ##P<0.01 vs Sham operation.

3.4 具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注大鼠心臟臟器指數(shù)的影響模型組大鼠心臟臟器指數(shù)相對假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷中、高劑量組MIRI大鼠心臟臟器指數(shù)降低，差異有顯著性(P<0.05)，提示具棲冬青苷預(yù)處理能有效減輕心肌缺血/再灌注損傷后的心臟組織炎性水腫。見Fig 6。

Fig 6 Effects of pedunculoside on HW/BW ratio in MIRI rats#P<0.05 vs Sham operation; *P<0.05 vs MIRI Model.

3.5 具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注大鼠生化指標(biāo)的影響與假手術(shù)組相比較，模型組血清SOD活性降低，差異有顯著性(P<0.01)；同時(shí)，MDA、CTnI水平增高，差異亦有顯著性(P<0.05)，說明模型制備成功。與模型組相比，卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷中、高劑量組大鼠血清SOD活性明顯提高，差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)；卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷低、中、高劑量組大鼠血清MDA含量均降低，差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)；CTnI含量卡托普利組、美托洛爾組、具棲冬青苷高劑量組明顯提高，差異有顯著性(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Effects of pedunculoside on level of SOD, MDA and CTnI in MIRI rats n=10)

4 討論

心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，嚴(yán)重者可導(dǎo)致心律失常、心肌頓挫、微血管受損及不可逆的細(xì)胞壞死和凋亡等。造成急性心肌缺血后再灌注損傷的機(jī)制主要包括微循環(huán)障礙、炎癥作用、心肌間質(zhì)水腫、鈣超載、白細(xì)胞侵入以及酸中毒等方面[15-16]。心肌缺血/再灌注損傷程度與心臟左室功能密切相關(guān)，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVSP、LVEDP、±dP/dtmax是反應(yīng)心臟收縮和舒張功能的重要指標(biāo)。定量組織學(xué)方法測定心肌梗死面積是心肌缺血研究最直觀的評價(jià)指標(biāo)。SOD、MDA、CTnI是心肌損傷的標(biāo)志物[17]。心肌細(xì)胞受損、細(xì)胞膜完整性破壞后，心肌酶等便會(huì)外漏釋放入血，臨床常以此診斷心肌損傷程度。SOD是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，MIRI時(shí)，SOD活性降低，導(dǎo)致氧自由基大量堆積，從而造成心肌損傷，使血清CTnI含量升高，同時(shí)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量升高?；谥兴幘缺貞?yīng)前期在心血管疾病治療作用方面的研究報(bào)道，開展其主要活性成分具棲冬青苷抗MIRI藥效學(xué)研究，為臨床尋找更好的心肌保護(hù)藥物提供參考。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)急性心肌缺血/再灌注損傷疾病的特點(diǎn)，通過結(jié)扎LAD 30 min，再灌注24 h制備大鼠急性心肌缺血/再灌注損傷模型，選擇臨床一線治療藥物β-受體阻滯劑美托洛爾與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的陽性對照藥，從心電圖、血流動(dòng)力學(xué)、心肌梗死面積、心臟臟器指數(shù)、血清生化指標(biāo)等方面探討具棲冬青苷的心肌保護(hù)作用。結(jié)果表明，與MIRI模型組比較，具棲冬青苷預(yù)處理組①心電圖ST段高度明顯降低，提示具棲冬青苷預(yù)處理可緩解心肌缺血及再灌注后心肌組織損傷；②血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)明顯改善，表現(xiàn)為LVSP和+dP/dtmax升高，LVEDP和-dP/dtmax降低，提示具棲冬青苷預(yù)處理對MIRI大鼠左室收縮和舒張功能有保護(hù)作用；③心肌梗死面積明顯下降，提示具棲冬青苷可減少心肌細(xì)胞持續(xù)壞死；④心臟臟器指數(shù)降低，提示具棲冬青苷可減少缺血/再灌注后心肌組織的炎性水腫，降低炎癥反應(yīng)；⑤反應(yīng)心肌損傷程度的CTnI水平降低，SOD活性升高，心肌組織過氧化產(chǎn)物MDA含量降低，提示具棲冬青苷預(yù)處理可降低心肌細(xì)胞損傷，且在眾多指標(biāo)的改善上并不弱于陽性藥卡托普利和美托洛爾。綜上可見，具棲冬青苷對急性心肌缺血/再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用可能與具棲冬青苷預(yù)處理增強(qiáng)SOD清除氧自由基能力，降低過氧化物MDA的生成，抑制心肌細(xì)胞凋亡，抵抗缺血/再灌注損傷后的心肌細(xì)胞持續(xù)性壞死，保護(hù)保護(hù)心臟功能相關(guān)；其詳細(xì)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。