煙草煙霧暴露結(jié)合基因工程小鼠在COPD藥物靶點(diǎn)及機(jī)制研究的應(yīng)用進(jìn)展

任周新，趙 迪，沈俊嶺，劉海軍，余海濱，李建生

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，河南 鄭州 450046；2. 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

基因工程技術(shù)包括ES細(xì)胞打靶技術(shù)、CRISPR 基因編輯技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，隨著技術(shù)的日臻完善，人類改變基因的能力正迅速增強(qiáng)。目前，在改變基因的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，小鼠的應(yīng)用頻率最高，建立了眾多與人類疾病有關(guān)的模型[1]。COPD的形成與惡化，決定于內(nèi)在基因與外在環(huán)境因素的共同作用。作為最主要的致病因素?zé)煵轃熿F暴露，結(jié)合不同的轉(zhuǎn)基因小鼠，能夠闡釋某種特定基因表達(dá)的變化對煙草煙霧暴露動(dòng)物肺損傷、關(guān)鍵信號(hào)通路等的影響，闡釋特定基因或信號(hào)通路在COPD病理機(jī)制中的作用，確定新的藥物作用靶點(diǎn)。本文就煙草煙霧暴露結(jié)合基因工程小鼠在COPD病理機(jī)制和藥物靶點(diǎn)方面的研究結(jié)果，進(jìn)行了綜合和分析，報(bào)導(dǎo)如下。

1 藥物靶點(diǎn)

1.1 Tristetraprolin (TTP)TTP是由鋅指蛋白36 (zinc finger protein-36，ZFP36) 基因編碼的一種RNA結(jié)合蛋白，通過與靶細(xì)胞因子的3′-非翻譯區(qū)的富含腺苷酸和尿苷酸的多種元件的結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA的破壞，特別是某些編碼炎癥的細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄本的破壞[2]，可能對COPD具有保護(hù)作用。TTP降低mRNA穩(wěn)定性的作用，被磷酸化和脫磷酸化的兩個(gè)特定的殘基所調(diào)控，在小鼠是磷脂酰絲氨酸52和178，在人類是磷脂酰絲氨酸60和186[3]。mitogen-activated protein kinase (MAPK)-activated protein kinase 2 (MK2)磷酸化TTP，并使之失活，導(dǎo)致靶mRNA的穩(wěn)定[4]。蛋白磷酸酶2A(PP2A)，使TTP脫磷酸化，提高其活性，促進(jìn)靶mRNA的穩(wěn)定性丟失[5]。而活化的TTP又被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)作為靶點(diǎn)，被其降解[5]。這些方式中，關(guān)鍵的磷脂酰絲氨酸的磷酸化控制了TTP的功能，這些磷脂酰絲氨酸如同一個(gè)分子開關(guān)：磷酸化，功能關(guān)閉，脫磷酸化，開放。所以，如果將TTP作為一個(gè)新的抗COPD的抗炎靶點(diǎn)，它具有易于控制的優(yōu)點(diǎn)。Nair等[5]使用了一種基因修飾的組成型的TTP活化小鼠品系，其內(nèi)源性TTP蛋白的磷脂酰絲氨酸52和178被不能被磷酸化的丙氨酸殘基所取代(Zfp36aa/aa)[6]。這兩個(gè)氨基酸殘基的置換，導(dǎo)致TTP結(jié)構(gòu)性的活化，起到一種mRNA脫穩(wěn)定性的作用。應(yīng)用Zfp36aa/aa小鼠，檢測活化的TTP對實(shí)驗(yàn)性煙草煙霧(cigarette smoke，CS)誘導(dǎo)COPD的影響。發(fā)現(xiàn)活化的TTP對實(shí)驗(yàn)性COPD的多種特征具有保護(hù)效應(yīng)，如肺炎癥減輕、氣道重構(gòu)減輕、肺泡擴(kuò)張減輕和肺功能改善。隨后在野生型的C57BL/6J小鼠中，用一種PP2A激動(dòng)劑(AAL(s))，以活化TTP，單獨(dú)或合用蛋白酶體抑制劑bortezomib，隨后評估這些干預(yù)對CS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性COPD的影響。結(jié)果表明藥物活化TTP能夠減輕疾病的典型表現(xiàn)。該研究結(jié)果展示出應(yīng)用藥物活化TTP，具有減輕COPD的潛能。

1.2 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)晚期糖基化終末產(chǎn)物受體是一種多配體的受體。煙草煙霧中含有RAGE的配體，已經(jīng)被證實(shí)是COPD的病原之一。野生型和RAGE基因敲除小鼠，分別暴露于CS。比較后發(fā)現(xiàn)，RAGE基因敲除小鼠的肺組織炎癥病變明顯減輕，肺泡灌洗液中炎癥相關(guān)因子和中性粒細(xì)胞數(shù)量減少。該結(jié)果表明敲除RAGE，能緩解CS誘導(dǎo)的氣道炎癥。cDNA微列陣比較后發(fā)現(xiàn)，作用途徑可能為S100A8/A9的表達(dá)下調(diào)以及與之相關(guān)的免疫-炎癥反應(yīng)下調(diào)[7]。另有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[8]：敲除RAGE基因或者應(yīng)用RAGE抑制劑FPS-ZM1，阻止CS誘導(dǎo)小鼠的肺氣腫的進(jìn)展。對暴露于CS的敲除RAGE小鼠或C57BL/6野生型小鼠的肺泡巨噬細(xì)胞執(zhí)行了無偏基因表達(dá)譜分析，通過比較，識(shí)別出一些COPD發(fā)病機(jī)制必需的基因，表明在CS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化中，RAGE是必需的組成部分[8]。兩種來源的細(xì)胞，最顯著的差異是Nrf2介導(dǎo)的基因表達(dá)。敲除RAGE小鼠巨噬細(xì)胞Nrf2介導(dǎo)的基因表達(dá)和肺組織4-羥基壬稀醛 (4-hydroxynonenal，4-HNE)減少，說明在CS刺激時(shí)，敲除小鼠的肺氧化應(yīng)激水平較低。但是，兩種小鼠CS暴露相同、肺泡灌洗液中的巨噬細(xì)胞數(shù)量相似、肺組織CD45陽性表達(dá)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞陽性表達(dá)細(xì)胞的百分率也相似[8]，提示CS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能需要RAGE的介導(dǎo)。另外，對于CS暴露，敲除小鼠巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的減弱[8]。這些研究表明：在CS誘導(dǎo)的肺巨噬細(xì)胞的活化過程和肺損傷過程中，RAGE具有重要的作用；抑制RAGE是COPD治療的新的可能的途徑。

1.3 衰老細(xì)胞細(xì)胞的衰老由Cdkn2a基因座所介導(dǎo)，其編碼兩個(gè)重要的腫瘤抑制因子，命名為p16Ink4a和 p19Arf [9]。Hashimoto等[10]通過消融Arf表達(dá)的細(xì)胞，構(gòu)建了一種ARF-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠，提高了小鼠的肺功能。預(yù)先用白喉毒素清除Arf表達(dá)的細(xì)胞，可減輕彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺損傷，對肺組織產(chǎn)生一定的保護(hù)效應(yīng)[11]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)：長期的煙草煙霧暴露導(dǎo)致肺功能異常，肺形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，衰老標(biāo)志性蛋白Ink4a和Arf在肺組織的表達(dá)增加；在煙草煙霧暴露前，清除Arf表達(dá)的細(xì)胞，減輕了上述煙霧誘導(dǎo)的表型變化。另外發(fā)現(xiàn)：在肺損傷后，清除Arf表達(dá)的細(xì)胞，在煙草煙霧提取物攻擊的小鼠中，也產(chǎn)生了有益的影響；初步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清除衰老細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，與巨噬細(xì)胞等分泌的彈性裂解酶的產(chǎn)量或活性降低有關(guān)[12]。這些結(jié)果提示：衰老細(xì)胞是COPD重要的治療靶點(diǎn)。

2 炎癥和免疫反應(yīng)

2.1 正常肺和炎癥肺正常的肺和炎癥的肺對于CS刺激反應(yīng)的比較，對于理解COPD的形成與發(fā)展是有益的。βENaC小鼠，是一種轉(zhuǎn)基因過表達(dá)Scnn1b的小鼠，該基因能夠編碼存在于氣道的上皮細(xì)胞的Na+通道β亞單位(βENaC)。βENaC小鼠具有脫水的氣道黏液，自發(fā)形成慢性支氣管炎和肺氣腫，包括黏液細(xì)胞化生、黏液高分泌、輕度的中性粒細(xì)胞性炎癥、大的泡沫狀巨噬細(xì)胞以及氣道黏液和氣道壁的淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加[13]。Engle等[14]應(yīng)用野生小鼠和βENaC慢性肺炎小鼠，暴露于CS或?qū)φ湛諝猓謩e暴露1 d和5 d。在肺組織或肺泡灌洗液中，對照βENaC小鼠的白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量、巨噬細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量均高于對照或CS野生小鼠，反映了βENaC小鼠自發(fā)性存在肺組織炎癥。CS刺激后，野生小鼠肺出現(xiàn)輕度的炎癥反應(yīng)。與βENaC對照組比較，CS暴露的βENaC小鼠白細(xì)胞數(shù)量、巨噬細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量均未見明顯變化；但中性粒細(xì)胞數(shù)量，盡管在暴露1 d，沒有差異；但在暴露5 d后，CS暴露的βENaC組反而顯著減少。兩種模型顯示出：暴露1 d的炎癥介質(zhì)的變化較暴露5 d的介質(zhì)變化，改變的數(shù)量更多。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果顯示：暴露1 d或5 d，野生或βENaC小鼠的許多基因和基因集的反應(yīng)相似，如氧化應(yīng)激的相關(guān)基因上調(diào)而免疫反應(yīng)的基因下調(diào)。僅有少許基因的調(diào)節(jié)和生物反應(yīng)存在不同：與對照的空氣暴露組比較，煙霧暴露組的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因和基因集，在暴露1 d上調(diào)，但在5 d下調(diào)。綜合分析，這些結(jié)果表明，一次煙霧暴露后，肺基因表達(dá)發(fā)生了快速的變化，重復(fù)性的短期暴露沒有明顯改變基因表達(dá)的變化；在已經(jīng)出現(xiàn)炎癥的肺組織，通過下調(diào)某些炎癥反應(yīng)，對重復(fù)的后續(xù)煙霧刺激損傷，具有一定的保護(hù)作用。該結(jié)果支持下述假說：對于煙霧刺激，早期的肺組織快速產(chǎn)生一些反應(yīng)，對于重復(fù)性肺損傷，產(chǎn)生保護(hù)作用[14]。該假說從某種程度上闡釋了吸煙者需要多年的吸煙史，長期而持續(xù)的煙霧刺激，才可能導(dǎo)致氣道和肺泡的病變，最終形成COPD。

2.2 繼發(fā)性免疫反應(yīng)細(xì)胞在COPD中，肺組織出現(xiàn)繼發(fā)性免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的增加，主要是浸潤的CD4+T，CD8+T和B淋巴細(xì)胞。CD8+T不足的小鼠(CD8-/-)，而不是CD4+T不足的小鼠，對CS誘導(dǎo)的肺損傷，具有一定的抵抗性，特別是阻止巨噬細(xì)胞的積聚、MMP2和MMP9活化以及肺氣腫[15]，表明在疾病的病理機(jī)制中，CD8+T細(xì)胞起到了某種關(guān)鍵的作用。與野生型對照組比較，缺乏成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞(Rag2-/-)的小鼠，在炎癥和肺氣腫方面，沒有變化[16]。然而，從CS暴露的野生小鼠中過繼輸送CD3+T細(xì)胞到Rag2-/-小鼠，后者就形成了類似COPD的表現(xiàn)，說明在COPD的形成和發(fā)展中，病原性的T細(xì)胞具有某種關(guān)鍵的作用。長期暴露于CS的野生型小鼠與Rag1-/-小鼠，肺炎和肺功能沒有差異，但Rag1-/-小鼠氣道膠原沉積更為嚴(yán)重，IL-33，IL-13以及ILC2的數(shù)量也增加；說明在實(shí)驗(yàn)性的COPD中，T/B淋巴細(xì)胞在氣道膠原沉積和纖維化中，發(fā)揮作用，但在炎癥中沒有作用[17]。

2.3 2型固有淋巴細(xì)胞2型固有淋巴細(xì)胞(group 2 innate lymphoid cells，ILC2s)，在溝通天然免疫反應(yīng)和繼發(fā)性免疫反應(yīng)以及維持肺內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面，發(fā)揮重要的作用[18]。ILCs細(xì)胞屬于組織定居的淋巴細(xì)胞，根據(jù)不同的刺激，這些細(xì)胞顯示出可塑性[19]。在COPD中，用IL-1β、IL-4和IL-12等刺激，ILC2s發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，形成了ILC1s細(xì)胞或ILC3S細(xì)胞；ILC1S：ILC2S比率的增加，與肺功能降低以及疾病的嚴(yán)重性之間，存在直接的相關(guān)性[19]。ILC2不足的轉(zhuǎn)基因Rorafl/flII7rCre小鼠與野生型小鼠，長期給予CS暴露，盡管Rorafl/flII7rCre小鼠的肺氣腫程度減輕，但膠原沉積以及IL-33和IL-13的表達(dá)沒有改善[17]。這些研究提示：ILC2s細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性COPD中，在CS誘導(dǎo)的氣道重構(gòu)和肺氣腫中，產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，但對炎癥沒有影響。

2.4 DNER/Notch通路在COPD的臨床研究中，全基因組關(guān)聯(lián)(genome-wide association studies，GWAS)方法得到了廣泛的應(yīng)用，成為獲取目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的候選基因或基因區(qū)域的有力工具[20]。應(yīng)用該技術(shù)，Busch等[21]發(fā)現(xiàn)吸煙者氣道上皮的DNER(Delta Notch like epidermal growth factor related receptor,DNER)內(nèi)在區(qū)的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與FEV1/FVC 比率或 FEV1之間，存在最顯著的相關(guān)性；與COPD的遺傳風(fēng)險(xiǎn)之間也存在關(guān)聯(lián)。

DNER是一種跨膜蛋白，屬于非經(jīng)典的Notch配體家族，它的膜外段與Notch1受體結(jié)合，以一種獨(dú)立于CSL(CBF1 Suppressor of Hairless，Lag-1)的方式，活化Notch通路。在人的肺組織中，DNER是促炎巨噬細(xì)胞的主要表型[22]。通過應(yīng)用DNER基因工程小鼠，結(jié)合煙草煙霧暴露，進(jìn)一步闡釋了DNER/Notch通路的作用機(jī)制：

首先，從煙草煙霧暴露的野生型小鼠中，發(fā)現(xiàn)肺組織巨噬細(xì)胞DNER表達(dá)升高，接著發(fā)現(xiàn)，促炎的M1骨髓源性巨噬細(xì)胞(M1 bone marrow derived macrophages，M1BMDM)DNER的表達(dá)升高[23]。隨后的研究選擇了一種敲除了DNER的小鼠，沒有發(fā)現(xiàn)敲除DNER對巨噬細(xì)胞的極化有影響，推測DNER在M1BMDM的高表達(dá)，可能通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路發(fā)揮作用[23]。采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)比較野生小鼠和敲除DNER小鼠的M1BMDM，發(fā)現(xiàn)干擾素(interferon，IFN)信號(hào)通路在野生小鼠最為富集，兩者差異明顯，這可能反映了敲除DNER小鼠的M1BMDM存在IFN信號(hào)通路的破壞或不足。接著發(fā)現(xiàn)敲除DNER小鼠的M1 BMDM細(xì)胞受到刺激后，II型干擾素(type II interferon，IFNγ)誘導(dǎo)表達(dá)顯著降低；GESA顯示M1的IFNγ信號(hào)富集，敲除小鼠低而野生小鼠高。盡管T細(xì)胞是IFNγ的主要來源，然而已經(jīng)分化的野生小鼠T細(xì)胞亞群表達(dá)很低的DNER，提示T細(xì)胞的DNER不可能調(diào)節(jié)產(chǎn)生大量的IFNγ；因此，高表達(dá)DNER的M1巨噬細(xì)胞才是導(dǎo)致IFNγ高表達(dá)的原因[23]。在隨后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，野生型小鼠和敲除DNER小鼠分別暴露于CS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在M1巨噬細(xì)胞內(nèi)，DNER表達(dá)被啟動(dòng)；IFNγ增加，需要DNER的表達(dá)；在慢性炎癥中，DNER調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌IFNγ；產(chǎn)生IFNγ的巨噬細(xì)胞屬于募集的巨噬細(xì)胞而不是定居的巨噬細(xì)胞；在肺募集的巨噬細(xì)胞內(nèi)，DNER調(diào)節(jié)IFNγ的分泌。最后發(fā)現(xiàn)敲除DNER小鼠的巨噬細(xì)胞內(nèi)，NICD1的核轉(zhuǎn)位顯著減少；兩種小鼠巨噬細(xì)胞的GSEA比較，野生小鼠的Notch1信號(hào)通路更為富集。據(jù)此認(rèn)為：借助于DNER，CS誘導(dǎo)體內(nèi)肺巨噬細(xì)胞的Notch1信號(hào)通路的活化，隨后誘導(dǎo)IFNγ高表達(dá)。

3 總結(jié)與展望

目前，COPD的個(gè)體化治療已經(jīng)成為共識(shí)，個(gè)體基因的異常是導(dǎo)致COPD出現(xiàn)不同臨床表型的重要因素[24]。個(gè)體化治療的本質(zhì)應(yīng)該反映COPD基因型在致病條件下的復(fù)雜而豐富的差異性變化。

隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)識(shí)別出了越來越多的COPD表型及其特異性的基因，建立了一種較為成熟的研究模式(Fig 1)。首先，通過GWAS等技術(shù)檢測正常人和COPD患者，發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異性強(qiáng)的基因和基因座，作為潛在的COPD易感基因和基因座。然后，選擇改變某個(gè)待篩查基因的小鼠和作為對照的野生小鼠，分別給予煙草煙霧刺激，比較兩者間COPD重要指標(biāo)的變化；另外，應(yīng)用激動(dòng)劑或拮抗劑干預(yù)該基因在COPD野生小鼠的表達(dá)，再次驗(yàn)證該基因是否與COPD的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。這種模式，在探索COPD發(fā)病機(jī)制和藥物干預(yù)靶點(diǎn)的研究中，已經(jīng)得到了應(yīng)用，取得了一定的進(jìn)展。

Fig 1 Pattern of combination of cigarette smoke exposure and genetically engineered mice for interest genes searches in COPD

未來，煙草煙霧暴露結(jié)合基因工程小鼠的研究模式，將推進(jìn)COPD復(fù)雜表型的準(zhǔn)確識(shí)別，促進(jìn)由不同的靶基因改變小鼠結(jié)合煙草煙霧暴露的COPD模型體系的建立與完善，推動(dòng)COPD個(gè)體化治療的建立與發(fā)展。