IL-4 基因甲基化在支氣管哮喘患兒及健康兒童中的表達(dá)差異

馬澤南，顧利華

1.蘇州市吳中人民醫(yī)院兒科，江蘇蘇州 215128；2.蘇州市吳中人民醫(yī)院麻醉科，江蘇蘇州 215128

支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病[1]，它主要是通過多種細(xì)胞（例如肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、以及氣道上皮細(xì)胞等等）與細(xì)胞組分參與的，此類慢性炎癥和氣道高反應(yīng)性有密不可分的關(guān)系，可逆性呼氣氣流受限是出現(xiàn)頻率較高的表現(xiàn)癥狀，具有廣泛、多變性，一般在夜晚與早間發(fā)作，嚴(yán)重程度也會(huì)加劇，大部分患者能夠通過治療改善或者自行減輕。倘若沒有及時(shí)診治支氣管哮喘，隨著時(shí)間不斷發(fā)展，可能會(huì)出現(xiàn)氣道不可逆性縮窄與氣道重塑[2-3]。距現(xiàn)在的研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，它的主要病因與遺傳有關(guān)，群體患病率要低于哮喘患者的親屬，而且患病率和患病的嚴(yán)重程度隨著親緣關(guān)系越來越近，患病率也會(huì)越來越高，這兩者呈正比增長(zhǎng)的趨勢(shì)[4]。該研究方便選取該院2016 年3 月—2019 年2 月收治的54 例支氣管哮喘患兒及54 名進(jìn)行門診體檢的健康兒童為研究對(duì)象，用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)IL-4 基因甲基化在支氣管哮喘患兒及健康兒童中表達(dá)差異展開分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

為研究IL-4 基因甲基化在支氣管哮喘患兒及健康兒童中的表達(dá)差異，方便選取該院收治的支氣管哮喘患兒54 例作為研究組，年齡5～12 歲，平均年齡為（7.0±1.5）歲；另選取同期該院進(jìn)行門診體檢的健康兒童54名作為對(duì)照組，年齡6～11 歲，平均年齡為（7.0±1.2）歲。兩組兒童在年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。該研究經(jīng)患兒及健康兒童的家屬知情同意。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

進(jìn)行確診時(shí)，要以中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)規(guī)定的，關(guān)于支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。支氣管哮喘具有以下臨床表現(xiàn)：①發(fā)作時(shí)伴有發(fā)作性咳嗽和胸悶癥狀，常常會(huì)出現(xiàn)呼氣性呼吸困難，夜間及凌晨發(fā)作和加重[5]。②干咳或咳大量白色泡沫痰，甚至出現(xiàn)發(fā)紺，哮喘癥狀發(fā)作的時(shí)間一般在數(shù)分鐘以內(nèi)，在經(jīng)過數(shù)小時(shí)到數(shù)天之后，可以通過支氣管舒張劑減輕癥狀，或者自行等待癥狀的緩解，在癥狀緩解數(shù)小時(shí)后，部分病患可能會(huì)再度發(fā)作。此外，在確診時(shí)，要一一排查，確保不是由于其他疾病造成的胸悶、氣急和咳嗽，最后就可以確診為支氣管哮喘。

1.3 測(cè)定3IL-4 基因甲基化的方法

1.3.1 提取1DNA 取研究組和對(duì)照組兒童的抗凝血各5 mL，用苯酚-氯仿法提取其中的DNA，在提取好DNA之后，對(duì)其含量與純度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)工具選擇分光光度儀與瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.2 修飾2DNA 用亞硫酸氫鈉處理并純化經(jīng)過提取得到的DNA，并放置-20℃的冰箱中，操作嚴(yán)謹(jǐn)，加入水（濃度為1%）100 mL，再加入6.8 μL 的NaOH（濃度為1 mol/L），搖勻，反應(yīng)在50℃條件下進(jìn)行15 min，然后加入558 μL 的修飾試劑Ⅰ混合，在50℃條件下反應(yīng)5～14 h，再加入試劑Ⅲ并搖勻，在試管中的液體中放入試劑Ⅱ700 μL 以及試劑Ⅱ5 μL，并搖勻，在室溫下反應(yīng)10 min，之后用5 000 r/min 的離心速度離心10 s，直到形成沉淀，并去掉上清液，再加入1 mL 的乙醇（70%）震蕩，用之前的離心速度離心8 s，也去掉上清液，重復(fù)操作3 次后再用之前的離心速度離心2 min，去掉上清液，完成對(duì)DNA 的修飾。

1.3.3 檢測(cè)甲基化的方法 經(jīng)過亞硫酸鈉對(duì)基因組DNA 的修飾，依照甲基化與非甲基化序列的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，采取PCR 擴(kuò)增。

1.3.4 PCR 擴(kuò)增方法 被修飾后的DNA1.8 μL 1.8×PCR 9.8 μL，甲基化上游引物1.1 μL，甲基化下游產(chǎn)物1.1 μL，滅菌雙蒸水6.2 μL，總共20 μL。IL-4 引物擴(kuò)增條件；95℃預(yù)變性6 min，再變性20 s，50℃退火20 s，70℃延伸20 s，循環(huán)25 次，70℃再延伸50 s。把擴(kuò)增產(chǎn)物放于4℃條件下，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)，對(duì)圖像分析的結(jié)論進(jìn)行掃描與采集。

1.4 判定5MSP

倘若有290 bp 擴(kuò)增條帶在IL-4 基因甲基化引物中出現(xiàn)，認(rèn)為甲基化存在，若291 bp 擴(kuò)增條帶在非甲基化引物中出現(xiàn)，則認(rèn)為非甲基化存在。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)選用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSP 的結(jié)果

在進(jìn)行MSP 檢測(cè)過程中，甲基化引物有290 bp 擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，非甲基化引物則有291 bp 擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，可以在IL-4 基因甲基化電泳圖譜中清楚地觀察到。

2.2 比較研究組與對(duì)照組的甲基化率

研究組的IL-4 基因完全甲基化率為31.48%（17/54），未甲基化率為18.52%（10/54），甲基化與未甲基化的共存率為50%（27/54），對(duì)照組的IL-4 基因完全甲基化率為14.81%（8/54），未甲基化率為44.44%（24/54），甲基化與未甲基化的共存率為40.74%（22/54），研究組的甲基化率與對(duì)照組的甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患兒IL-4 基因甲基化率比較[n（%）]

3 討論

支氣管哮喘病發(fā)生的因素除了遺傳因素之外，還有一些變應(yīng)原的因素導(dǎo)致小兒發(fā)生支氣管哮喘。最常見并且危害最大的室內(nèi)變應(yīng)原是塵螨，是世界范圍內(nèi)哮喘發(fā)病的重要原因[6]，而最普遍的導(dǎo)致哮喘發(fā)作的室外變應(yīng)原是花粉和草粉，還有其他各種特異以及非特異性吸入物，比如：二氧化硫、動(dòng)物毛屑和氨氣等。而谷物粉、茶、咖啡豆、家蠶、鴿子、蘑菇、抗生素、活性染料、乙二胺等屬于常見的職業(yè)性變應(yīng)原[7-8]，此外藥物導(dǎo)致哮喘的變應(yīng)原則是普萘洛爾（心得安）、阿司匹林與部分非皮質(zhì)激素類抗炎藥[9]，除此之外，誘發(fā)哮喘的因素也包含蝦、魚、蛋類和牛奶等食物。除了以上這些，日常生活中存在的空氣污染、吸煙產(chǎn)生的氣體，還有氣候的變化，或者劇烈運(yùn)動(dòng)吸入冷空氣，具有感染性的細(xì)菌、原蟲、病毒以及寄生蟲等，這些因素都是引發(fā)哮喘發(fā)作的原因。

兒童患有支氣管哮喘，會(huì)升高IL-4 基因甲基化，由此可以發(fā)現(xiàn)IL-4 基因甲基化對(duì)IL-4 的分泌有促進(jìn)作用，對(duì)IgE 的合成有重要影響，IL-4 基因在靜息CD4+中，處于非甲基化，IL-4 甲基化與過敏原接觸過后，IL-4啟動(dòng)區(qū)甲基化程度升高，使得產(chǎn)生大量IL-4，引起支氣管哮喘的發(fā)生[5，9-10]。

小兒哮喘發(fā)作與呼吸道感染有緊密的聯(lián)系，特別是病毒和支原體感染。絕大部分嬰幼兒哮喘，是呼吸道感染造成的，呼吸道病毒是其主要的病原體，研究證實(shí)，喘息是由于合胞病毒感染可因發(fā)生特異性免疫球蛋白IgE 介導(dǎo)I 型變態(tài)反應(yīng)而產(chǎn)生的。成人對(duì)塵螨的過敏比兒童期要少，塵螨存活的最短適宜季節(jié)是春秋季節(jié)，所以春秋季節(jié)是塵螨性哮喘發(fā)作的高峰期，患者多于夜間發(fā)作。兒童對(duì)外界氣候的變化是非常敏感的，比如驟然變冷的氣溫或者氣壓的降低，往往都會(huì)導(dǎo)致哮喘發(fā)作，所以，兒童在春秋兩個(gè)季節(jié)發(fā)病率明顯較高。也有研究表明哮喘兒童也常受情緒影響，在情緒激動(dòng)時(shí)或其他心理活動(dòng)障礙時(shí)常伴有迷走神經(jīng)興奮而引起哮喘發(fā)作。

對(duì)于兒童哮喘病的治療，應(yīng)遵照持續(xù)性、規(guī)范性、長(zhǎng)期性與個(gè)體化治療的原則，處于急性發(fā)作期階段，應(yīng)該迅速對(duì)癥狀采取緩解措施、進(jìn)行抗炎治療、平喘、祛痰、鎮(zhèn)靜、抗過敏。防止與致敏原進(jìn)行接觸。選用抗生素，在慢性持續(xù)期時(shí)應(yīng)防止癥狀加重，防止氣道重塑，加強(qiáng)身體鍛煉、合理調(diào)節(jié)室溫、提高自我管理水平、采取藥物和非藥物結(jié)合治療，多功能治療防護(hù)措施要做好，此外哮喘防治教育、及時(shí)處理患兒心理問題、回避變應(yīng)原、提高生命質(zhì)量、藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)等非藥物治療，對(duì)長(zhǎng)期管理哮喘能夠起到關(guān)鍵作用，不能過分忽視。

研究組的IL-4 基因甲基化率與對(duì)照組比較，研究組中的支氣管哮喘患兒的IL-4 基因完全甲基化率為44.44%（24/54），未甲基化率為18.52%（10/54），甲基化與未甲基化的共存率為50%（27/54），對(duì)照組的IL-4 基因完全甲基化率為14.81%（8/54），未甲基化率為37.04%（20/54），甲基化與未甲基化的共存率為40.74%（22/54），甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與韓繼紅等人[11]的研究結(jié)果相一致：研究組IL-4 基因完全甲基化率為42.5%(34/80)，未甲基化率為25.0%(20/80)，甲基化和未甲基化共存率為32.5%(26/80)；對(duì)照組IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)完全甲基化率為11.3%（9/80），未甲基化率為46.3%（37/80）；甲基化和未甲基化共存率為42.5%（34/8），重度發(fā)病期患兒的IL-4 表達(dá)水平明顯高于輕度發(fā)病期和緩解期。

綜上所述，IL-4 甲基化的表達(dá)的差異對(duì)支氣管哮喘的患兒有著一定的影響。