早期隱性梅毒對慢性HIV感染者CD4+T及CD8+T淋巴細胞內Caspase-1/3水平的影響

宋冰冰 趙金雪 翁文佳 高艷青

1首都醫(yī)科大學附屬北京康復醫(yī)院皮膚科,北京，100041；2北京市房山區(qū)第一醫(yī)院皮膚科，北京，102400；3首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院皮膚科，北京，100069

隨著HIV/AIDS的流行及其他危險因素的增多，如男男性接觸(men who have sex with men，MSM)、靜脈注射毒品，梅毒合并HIV的感染率越來越高。研究發(fā)現(xiàn)兩種疾病可相互作用，如梅毒合并HIV感染且CD4+T淋巴細胞<350個/μL，發(fā)生神經梅毒概率增高[1，2]；另外，合并梅毒感染會加快HIV患者CD4+T淋巴細胞計數(shù)下降、HIV載量升高，促進HIV感染進展為AIDS[3]。既往課題組研究[4]發(fā)現(xiàn)梅毒感染加快HIV感染者CD8+T淋巴細胞的凋亡，并且除了活化誘導的凋亡外，可能存在其他的機制。而對于HIV感染者CD4+T淋巴細胞，研究發(fā)現(xiàn)HIV有效感染的活化CD4+T細胞發(fā)生死亡是通過Caspase-3介導的凋亡，HIV無效感染的靜止CD4+T淋巴細胞發(fā)生死亡是通過Caspase-1誘導的焦亡[5]。而梅毒是否能通過上述途徑加速CD4+T及CD8+T淋巴細胞的死亡尚未有明確報道。本研究通過觀察早期梅毒感染對HIV感染者CD4+T及CD8+T細胞Caspase-1/3水平的影響，初步探索早期隱性梅毒感染對HIV感染者外周血中CD4+T及CD8+T淋巴細胞凋亡和焦亡的影響。

1 材料與方法

1.1 病歷資料 研究對象來自我院感染中心規(guī)律隨訪的MSM隊列。18例早期隱性梅毒合并慢性HIV感染(外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)≥350個/μL，HIV感染時間>6個月) ，早期隱性梅毒定義為感染2年內僅有梅毒血清學改變，但無任何臨床表現(xiàn)；18例慢性 HIV感染(外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)≥350個/μL，HIV感染時間>6 個月)。除外年齡<18歲、妊娠、合并其他感染性疾病者，如結核感染等。合并組確診梅毒后經過芐星青霉素240萬U驅梅治療，每周一次，共三次。所有HIV感染者均未進行抗高效逆轉錄病毒治療(HAART)。見表1。

表1 兩組患者基線資料

1.2 研究方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度離心法分離PBMC 合并組及HIV感染組取凍存PBMC，于42℃恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，快速晃動凍存管，使凍存的細胞在1 min內解凍。

1.2.2 熒光染色 復蘇好的PBMC加入表面抗體標記(CD3-APC，CD4-PERCP，CD8-APC-cy7)，室溫避光染色20 min。細胞內染色：加入Caspase-3，Caspase-1抗體，室溫孵育45 min，PBS洗滌2次后，用2%多聚甲醛重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.2.3 CD4/CD8及細胞內Caspase-1/Caspase-3測定 采用FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)檢測，并采用 Flowjo 7.6.1軟件進行數(shù)據分析。

2 結果

2.1 兩組CD4+T淋巴細胞中Caspase-1/3含量的比較 見圖1、2 。單純HIV感染組及合并組CD4+T淋巴細胞中Caspase-1含量分別為(0.132±0.098)、(0.463±0.676)，合并組高于單純HIV組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義；單純HIV感染組及合并組CD4+T淋巴細胞中Caspase-3含量分別為(4.717±7.35)、(9.433±11.85)，兩組未見統(tǒng)計學差異。

圖1 HIV單純感染組和HIV合并早期隱性梅毒感染組中CD4+T淋巴細胞中Caspase-1含量情況，*P<0.05 圖2 HIV單純感染組和HIV合并早期隱性梅毒感染組中CD4+T淋巴細胞中Caspase-3含量情況，*P<0.05 圖3 HIV單純感染組和HIV合并早期隱性梅毒感染組中CD8+T淋巴細胞中Caspase-1含量情況，*P<0.05 圖4 HIV單純感染組和HIV合并早期隱性梅毒感染組中CD8+T淋巴細胞中Caspase-3含量情況，*P<0.05

2.2 兩組CD8+T淋巴細胞中Caspase-1/3含量的比較 見圖3、4。單純HIV感染組及合并組CD8+T淋巴細胞中Caspase-1含量分別為(0.127±0.094)、(0.334±0.456)，合并組高于單純HIV組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義；單純HIV感染組及合并組CD8+T淋巴細胞中Caspase-3含量分別為(8.47±14.78)、(16.23±14.91)，兩組未見統(tǒng)計學差異。

2.3 合并組治療6個月后CD4+T淋巴細胞中Caspase-1/3含量與基線的比較 芐星青霉素驅梅治療6個月后，CD4+T淋巴細胞中Caspase-1含量為(0.156±0.103)，較治療前下降，但無統(tǒng)計學差異。Caspase-3含量為(2.32±3.925)，較前明顯下降，有統(tǒng)計學意義。見圖5、6。

2.4 合并組治療6個月后CD8+T淋巴細胞中Caspase-1/3含量與基線的比較 芐星青霉素驅梅治療6個月后，CD8+T淋巴細胞中Caspase-1含量為(0.158±0.108)，較治療前下降，但無統(tǒng)計學差異；Caspase-3含量為(2.38±2.05)，較前明顯下降，有統(tǒng)計學意義。見圖7、8。

2.5 單純HIV感染組6個月定期隨訪時CD4+T淋巴細胞中Caspase1/3含量分別為(0.076±0.066)及(1.53±1.828)，CD8+T淋巴細胞中Caspase1/3含量分別為(0.067±0.07)及(2.156±3.026)，均與基線無統(tǒng)計學差異。

圖5 HIV合并早期隱性梅毒感染組在治療前和治療6個月后CD4+T淋巴細胞中Caspase-1含量變化情況，*P<0.05 圖6 HIV合并早期隱性梅毒感染組在治療前和治療6個月后CD4+T淋巴細胞中Caspase-3含量變化情況，*P<0.05 圖7 HIV合并早期隱性梅毒感染組在治療前和治療6個月后CD8+T淋巴細胞中Caspase-1含量變化情況，*P<0.05 圖8 HIV合并早期隱性梅毒感染組在治療前和治療6個月后CD8+T淋巴細胞中Caspase-3含量變化情況，*P<0.05

3 討論

HIV感染后，會攻擊人體免疫系統(tǒng)，人體細胞免疫會明顯受損，而梅毒是以細胞免疫為主參與梅毒螺旋體的清除[2，6，7]。故既往研究[8，9]發(fā)現(xiàn)二者可相互影響，促進疾病發(fā)展，及時有效的治療對疾病的轉歸會有幫助。

在HIV感染過程中，CD4+T淋巴細胞進行性減少是疾病進展的核心環(huán)節(jié)。既往研究[10]發(fā)現(xiàn)HIV感染的CD4+T淋巴細胞減少與凋亡密切相關，但隨著研究的深入，不同于凋亡與壞死的一種新的程序性細胞死亡方式-焦亡被發(fā)現(xiàn)，它是由Caspase-1介導，在許多感染性疾病中發(fā)揮重要作用。在HIV感染的致病機制研究中認為，CD4+T淋巴細胞主要通過焦亡的方式對病毒DNA作出反應,從而促進前炎癥因子釋放,使大量健康CD4+T淋巴細胞募集到感染區(qū)域,為HIV感染提供新的細胞資源,最后導致CD4+T淋巴細胞死亡,形成惡性循環(huán)[11]。目前認為HIV有效感染的活化CD4+T淋巴細胞發(fā)生死亡是通過Caspase-3介導的凋亡，HIV無效感染的靜止CD4+T淋巴細胞發(fā)生死亡是通過Caspase-1誘導的焦亡[10，11]。

目前研究認為梅毒螺旋體的清除主要是通過細胞免疫參與。在梅毒感染的過程中，其外周血T淋巴細胞亞群不斷發(fā)生變化。既往研究顯示[12]，二期梅毒患者外周血中CD4+T淋巴細胞比例顯著降低,而CD8+T淋巴細胞比例顯著升高,CD4+∶CD8+比值降低;而一期和潛伏梅毒患者, CD4+和CD8+T淋巴細胞的比例無顯著變化。此研究表明T淋巴細胞亞群在梅毒的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，不同梅毒分期T淋巴細胞亞群變化的機制可能揭示梅毒的致病機制。另外發(fā)現(xiàn)，一、二期梅毒患者外周血中CD4+T淋巴細胞凋亡比例明顯升高，而早期潛伏梅毒患者CD4+T淋巴細胞凋亡比例增高無統(tǒng)計學意義，提示不同分期梅毒患者外周T淋巴細胞死亡機制可能不同。關于梅毒螺旋體感染過程中T淋巴細胞亞群的焦亡情況尚無研究報道，本課題組目前正在對不同分期的單純梅毒感染者外周血T淋巴細胞亞群焦亡及凋亡情況進行研究。本研究初步分析梅毒螺旋體感染對梅毒合并HIV共感染者外周血中CD4/CD8+T淋巴細胞亞群焦亡和凋亡的影響，提高我們對梅毒和AIDS病理機理的認識，為進一步深入研究提供基礎。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)早期隱性梅毒合并HIV感染CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞中焦亡指標Caspase-1較單純HIV感染組明顯升高，反應在一定程度上梅毒可能通過焦亡途徑加速共感染者中CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞的死亡。合并組中CD4/CD8+T淋巴細胞雖然凋亡指標Caspase-3也呈增加趨勢，但無統(tǒng)計學差異，一方面可能與樣本量較小有關，另一方面，本研究組為早期隱性梅毒患者，免疫反應不如一期、二期梅毒強烈，這與既往單純早期隱性梅毒未增加CD4+T淋巴細胞的凋亡相符[12]。另外，在經過芐星青霉素驅梅治療后，CD4/CD8+T淋巴細胞的凋亡指標Caspase-3明顯下降，反應及時有效的驅梅治療可以降低梅毒螺旋體對CD4/CD8+T淋巴細胞的影響。驅梅治療對焦亡指標Caspase-1的水平雖有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義。

梅毒和AIDS都是性傳播疾病，T淋巴細胞在二者的病理機制中具有重要意義，探索兩種感染對CD4+和CD8+T淋巴細胞不同的程序死亡通路的影響，可以提高我們對梅毒和AIDS病理機制的認識，有助于研發(fā)新的有效控制梅毒感染和AIDS進展的治療策略。同時，梅毒的早期診斷和治療對于CD4+和CD8+T淋巴細胞的更新具有重要意義。

由于本研究樣本量較小，我們的研究假設仍需要大樣本的研究進一步證實。同時，增加一組單純早期隱性梅毒可能會更全面的說明本文結論。另外，Caspase可能僅是T淋巴細胞程序性死亡通路的一個效應分子，梅毒螺旋體是否會通過其它途徑影響HIV感染者CD4/CD8+T淋巴細胞的更新仍需要進一步研究，還需將不同分期的早期梅毒納入研究，進一步觀察梅毒在不同的感染階段對CD4/CD8+T淋巴細胞更新的影響。