潘展硯 吳 瓊 王嵐琦 胡婷婷 鞠 強(qiáng)
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院皮膚科,上海,200127
皮膚癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率遠(yuǎn)高于肺癌、肝癌等內(nèi)臟腫瘤[1]。皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率較高,容易轉(zhuǎn)移,對(duì)患者的生命帶來巨大的威脅。尋找與皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能基因,給對(duì)cSCC的早期診斷和精準(zhǔn)治療有重要意義[2]。核糖體合成調(diào)控因子1(RRS1)參與rRNA的加工及核糖體生物合成。研究顯示,RRS1基因在許多人類腫瘤中過表達(dá),如宮頸癌、甲狀腺乳頭狀癌、肝癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等,并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[3-6]。但是RRS1在皮膚腫瘤上的相關(guān)研究未有報(bào)道。本研究通過對(duì)臨床標(biāo)本的免疫組織化學(xué)研究RRS1在cSCC的表達(dá),RRS1基因敲低的方法研究其對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響。
1.1 臨床資料 收集2014年9月至2019年6月來自上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院皮膚科和整形外科手術(shù)存檔蠟塊,其中正常皮膚15例,cSCC 15例。以上標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實(shí),且所有病例手術(shù)前均未經(jīng)化療、放療及其他免疫治療。正常對(duì)照組,男8例,女7例,年齡59~85歲,平均(70.00±8.09)歲;cSCC組,男8例,女7例,年齡67~88歲,平均(71.87±8.35)歲。cSCC組與對(duì)照組的年齡及性別等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性。
1.2 材料和試劑 兔抗人RRS1抗體購自美國(guó)abcam公司(ab188161),GADPH抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒(鼠/兔)、粉劑型檸檬酸抗原修復(fù)液、粉劑型 PBS磷酸鹽緩沖液購自福建邁新公司。人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系 SCL-1(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液(美國(guó)HyClone公司),胎牛血清(中國(guó)山東博康公司),青鏈霉素混合液(中國(guó)北京索萊寶公司),轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000、Trizol Reagent(美國(guó)Invitrogen公司),RRS1干擾慢病毒、GV115質(zhì)粒(中國(guó)上海吉?jiǎng)P公司),Matrigen基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司),Transwell小室(美國(guó)Millipore公司),RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)。
1.3 免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判斷 將所有標(biāo)本以4 μm厚度連續(xù)切片,將組織切片常規(guī)脫蠟。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照,用試劑公司提供的已知陽性切片作為陽性對(duì)照。所有標(biāo)本用檸檬酸修復(fù)抗原。滴加一抗,37℃孵育60 min;PBS 緩沖液沖洗3 min×3次,滴加二抗,室溫孵育30 min,PBS緩沖液沖洗3 min×3次,滴加新鮮配制的DAB顯色,鏡下控制顯色時(shí)間,及時(shí)終止顯色; 依次蘇木素復(fù)染,乙醇脫水,二甲苯透明,風(fēng)干,樹脂封片。結(jié)果判斷:RRS1以腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號(hào)。采用雙育法,每例均隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400),以顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。采用半定量法判斷結(jié)果:陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分,5%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分;陽性強(qiáng)度:無染色為0分,黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;陽性細(xì)胞數(shù)分和陽性強(qiáng)度分相乘,0分為(-),1~4分為(+),5~8分為(++),9~12分為(+++)。
1.4 慢病毒的構(gòu)建 從NCBI中獲取RRS1基因的全部序列,由上海吉?jiǎng)P公司合成熒光標(biāo)記的慢病毒,選擇編號(hào)為GV115的質(zhì)粒載體。設(shè)計(jì)多個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列,經(jīng)過評(píng)估測(cè)定后,選用RRS1干擾靶點(diǎn)序列為:GCTGCCTTCATTGAGTTTA。熒光標(biāo)記的慢病毒感染細(xì)胞,檢測(cè)病毒感染SCL-1細(xì)胞的滴度。
1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 使用含有10%胎牛血清和0.01%青鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) SCL-1細(xì)胞。傳代后,在6孔板中培養(yǎng) SCL-1細(xì)胞,當(dāng)匯合率到70%左右時(shí),加入病毒,確保病毒感染效率在80%左右。SCL-1細(xì)胞感染慢病毒空載體為Mock組,感染慢病毒shRNA-RRS1為shRNA組。
1.6 QRT-PCR檢測(cè) 使用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)從細(xì)胞中提取總RNA。RNA濃度通過NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL,USA)測(cè)定。根據(jù)制造商的規(guī)程,使用First-Strand cDNA Synthesis試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)對(duì)20~100 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在LightCycler 480系統(tǒng)(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)上進(jìn)行qRT-PCR,并用于分析mRNA的表達(dá)水平。使用GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照,計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。
表1 Real-time PCR的引物序列
1.7 Western blotting實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞,每組加入200 μL 的裂解液,置于冰上充分裂解 30 min,收集細(xì)胞裂解液,12000 rpm、4℃條件下離心12 min,收集上清液。BCA法檢測(cè)上清液中總蛋白濃度,每孔上樣40 μg進(jìn)行電泳分離,恒壓70 V,電泳3 h。然后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉1 h后,將印跡膜放入對(duì)應(yīng)的一抗溶液(稀釋比1∶1000) 中,4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次,每次10 min,再把條帶放入盛二抗(稀釋比1∶1500) 的平皿中室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min。加入4 mL的ECL顯影液顯色3 min,凝膠成像系統(tǒng)曝光。
1.8 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 shRNA-Mock組、shRNA組細(xì)胞。將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,細(xì)胞數(shù)為1×105/mL。培養(yǎng)8~12 h細(xì)胞長(zhǎng)至單層后,并加入5 mg/mL的MTT 10 μL,5% CO2孵育4 h,每孔加入二甲基亞砜100 μL,常溫下,搖勻10 min,酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)下的吸光度A值,表示細(xì)胞活性,兩組均設(shè)6個(gè)實(shí)驗(yàn)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.9 Celigo劃痕實(shí)驗(yàn)分析RRS1基因?qū)CL-1細(xì)胞遷移能力的影響 SCL-1細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒48 h后,待組細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,鋪96孔板,用劃痕儀在培養(yǎng)皿刮擦細(xì)胞以產(chǎn)生劃痕區(qū)域,并用無血清培養(yǎng)基徹底沖洗以除去所有細(xì)胞碎片。然后在96孔板中加入培養(yǎng)基。使用Celigo細(xì)胞儀(美國(guó)Nexcelom公司)拍攝并檢測(cè)細(xì)胞熒光。Celigo細(xì)胞儀自動(dòng)計(jì)算遷移面積,遷移率為遷移細(xì)胞面積(9 h)/劃痕面積(0 h)×100%,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.10 Transwell實(shí)驗(yàn)分析RRS1基因?qū)CL-1細(xì)胞侵襲能力的影響 Matrigen基質(zhì)膠包被Transwell小室基底膜。SCL-1細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒48 h后,待組細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,將細(xì)胞種于24孔板并且置于Transwell小室中,上室加入0.1 mL無血清培養(yǎng)基,下室加入0.5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h,觀察細(xì)胞遷移情況。取出Transwell小室用PBS洗2次,甲醛固定,用吸水紙吸去上室培養(yǎng)基,滴結(jié)晶紫在小室下表面進(jìn)行染色,5 min后,沖洗結(jié)晶紫,空氣晾干后顯微鏡下進(jìn)行拍照(×100),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.11 GEO腫瘤數(shù)據(jù)庫分析RRS1在cSCC中的表達(dá) GEO腫瘤表達(dá)數(shù)據(jù)庫含有一項(xiàng)正常皮膚(6例)和皮膚鱗狀細(xì)胞癌(5例)表達(dá)譜數(shù)據(jù)(GDS2200),可查得RRS1在各樣本中mRNA相對(duì)表達(dá)量。
2.1 RRS1在cSCC和正常皮膚中的表達(dá) GEO腫瘤表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GDS2200)顯示RRS1在cSCC組相對(duì)表達(dá)均值為3342.36±1312.33,在正常皮膚組為1458.55±504.02,P<0.01。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示RRS1在正常皮膚、cSCC中表達(dá)于細(xì)胞核。圖1示RRS1在cSCC表達(dá)顯著高于正常皮膚(P<0.01)(表2)。
表2 RRS1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
圖1 1a:正常皮膚RRS1主要表達(dá)在皮膚細(xì)胞核中,表達(dá)評(píng)分為+(免疫組化,×200);1b:cSCC皮損RRS1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞核中,表達(dá)評(píng)分為+++(免疫組化,×200)
2.2 RRS1對(duì)SCL-1細(xì)胞增殖的影響 QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示感染慢病毒后,RRS1的敲減效率達(dá)到74%。Western blot結(jié)果證實(shí)RRS1被成功敲減(圖2)。細(xì)胞鋪于96孔板。MTT連續(xù)檢測(cè)5天,發(fā)現(xiàn)shRNA組相比shRNA-Mock組的細(xì)胞增殖速率受到顯著抑制。圖2提示RRS1基因與SCL-1細(xì)胞的增殖能力顯著相關(guān)。
2.3 RRS1對(duì)SCL-1細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)移和侵襲性的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,shRNA組細(xì)胞遷移率為(45.79±1.10)%,Mock組細(xì)胞遷移率為(64.56±3.33)%,P<0.01。shRNA組細(xì)胞遷移率與Mock組細(xì)胞相比明顯降低。Transwell結(jié)果表明,shRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)為105±2.51,Mock組175±5.41,P<0.01。shRNA組細(xì)胞侵襲能力與Mock組細(xì)胞相比明顯降低(圖2)。
2a:QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示感染慢病毒后,RRS1的敲減效率達(dá)到74%。Western blot結(jié)果證實(shí)RRS1被成功敲減;2b:MTT連續(xù)檢測(cè)5天,發(fā)現(xiàn)shRNA組相比Mock組的細(xì)胞增殖速率受到顯著抑制;2c:兩組細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)24小時(shí)拍攝的顯微鏡照片(×100);2d:兩組細(xì)胞在0小時(shí)和9小時(shí),Celigo細(xì)胞儀拍攝并檢測(cè)細(xì)胞熒光照片(×100);2e:Transwell結(jié)果表明,shRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)為105±2.51,Mock組175±5.41;2f:劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,shRNA組細(xì)胞遷移率為(45.79±1.10)%,Mock組細(xì)胞遷移率為(64.56±3.33)%。**與Mock組相比P<0. 01
2.4 RRS1對(duì)增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)基因表達(dá)的影響 QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,增殖相關(guān)基因FGF2,AREG,cyclin E1在shRNA組顯著降低,P<0.01。轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)基因VIM、CXCL1、CXCL3、CXCL8、MMP1在shRNA組顯著降低,P<0.01(表3)。
表3 RRS1敲低后細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)變化
核糖體合成調(diào)節(jié)因子1(RRS1)是由203個(gè)氨基酸組成的核蛋白,對(duì)于核糖體合成至關(guān)重要,它可以根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)核糖體合成速度,然后維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。RRS1的異常表達(dá)對(duì)核糖體的合成有負(fù)面影響,導(dǎo)致核糖體的生理功能異常[7]。一些研究顯示惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與RRS1的異常表達(dá)密切相關(guān)。Song等[8]使用RNA干擾技術(shù)來降低RRS1基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂時(shí)間明顯延長(zhǎng),表明乳腺癌細(xì)胞中RRS1基因的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖有關(guān)。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)肝癌組織中與RRS1基因表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,且RRS1基因與肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。最近的研究表明,RRS1在結(jié)腸癌中過表達(dá),并且與腫瘤增殖有關(guān)[6]。有研究顯示,在細(xì)胞和動(dòng)物模型上,長(zhǎng)非編碼RNA可以通過抑制RRS1的表達(dá)從而抑制乳腺癌的形成和進(jìn)展[9]。MicroRNA-598也可以通過下調(diào)RRS1的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。因此認(rèn)為RRS1基因是腫瘤治療中的新的潛在靶標(biāo)。
RRS1在皮膚腫瘤中的研究還未見相關(guān)報(bào)道。本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,RRS1在人正常表皮和cSCC皮損中均有表達(dá),顯示RRS1在皮膚細(xì)胞中有生理學(xué)功能。RRS1在cSCC皮損中的表達(dá)高于正常皮膚,GEO的表達(dá)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)也證實(shí)了這個(gè)結(jié)果,提示RRS1的高表達(dá)與cSCC的發(fā)病高度相關(guān)。我們用皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞進(jìn)一步探索了RRS1的功能作用,結(jié)果顯示慢病毒敲低RRS1后,SCL-1細(xì)胞的增殖活性、轉(zhuǎn)移和侵襲能力均大幅度降低。這些結(jié)果均提示RRS1在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)RRS1的表達(dá),可能成為防治cSCC的新策略。
我們初步探索了RRS1的作用機(jī)制。結(jié)果顯示RRS1敲低后,腫瘤增殖相關(guān)基因FGF2、AREG、cyclin E1表達(dá)降低。FGF2和AREG是癌基因,與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān),也是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]。Cyclin E1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白,其過量表達(dá)可使CDK2持續(xù)激活,從而使細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。RRS1敲低后,轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)基因VIM,MMP1、CXCL1、CXCL3、CXCL8表達(dá)也顯著增高。VIM(波動(dòng)蛋白)表達(dá)增高與腫瘤的局部轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12,13]。多個(gè)基因芯片研究顯示MMP-1是cSCC疾病的關(guān)鍵基因,可以預(yù)測(cè)疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后[14]。CXCL1、CXCL3、CXCL8是趨化因子家族成員,與cSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。RRS1敲低后這些基因表達(dá)的改變,解釋了其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性、轉(zhuǎn)移和侵襲能力作用的機(jī)制。
綜上所述,RRS1在cSCC中表達(dá)明顯增高。RRS1可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖活性、轉(zhuǎn)移和侵襲能力。RRS1表達(dá)影響了腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的相關(guān)基因。進(jìn)一步研究需要明確RRS1與cSCC分期和疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系,明確RRS1具體作用機(jī)制,明確調(diào)控RRS1表達(dá)的因素。使RRS1成為cSCC新的生物學(xué)標(biāo)志和治療靶點(diǎn)。