白癜風動物模型研究進展

黃新綠 杜 娟 徐前喜 王 芳 李 曼 張艷坤 丁曉嵐

北京大學人民醫(yī)院皮膚科，北京，100044

白癜風(vitiligo)是獲得性色素脫失性皮膚病，以表皮黑素細胞缺失而出現(xiàn)皮膚和黏膜白斑為特征。白癜風的病因和發(fā)病機制尚未被完全闡明，是該領域的研究重點和難點。目前公認本病是在遺傳、自身免疫、氧化應激和環(huán)境等多種因素共同作用下導致黑素細胞破壞所致。

動物模型是研究疾病發(fā)病機制和開發(fā)新治療的可靠工具。由于白癜風是多因性疾病，現(xiàn)有的動物模型均不能完全模擬白癜風發(fā)病的所有機制，而是各有側重和優(yōu)勢。白癜風動物模型主要包括自發(fā)性模型和誘導性模型。自發(fā)性白癜風模型包括辛克萊豬、Smyth line雞和mivit/mivit鼠系等[1,2]。誘導性白癜風模型以小鼠模型為主，主要通過誘導黑素細胞氧化損傷、注射黑素細胞特異性抗原誘導內源性免疫細胞、注射外源性T細胞以及轉基因等方法建立(表1)。這些誘導方法模擬了白癜風發(fā)病過程中的不同環(huán)節(jié)，更接近人類白癜風的發(fā)病機制。近年來在誘導性白癜風模型的基礎上也發(fā)現(xiàn)了一些新的治療靶點。本文綜述了常用的誘導性白癜風動物模型及相關進展。

1 黑素細胞應激誘導的白癜風模型

黑素細胞氧化損傷是白癜風發(fā)病的重要機制之一。近年來有研究證實，氧化應激和自身免疫存在聯(lián)系，黑素細胞應激可以激活體內免疫反應，導致黑素細胞損傷。國內很早就有采用化學脫色法制備白癜風動物模型的報道。使用強氧化劑過氧化氫外用于豚鼠皮膚，導致黑素細胞氧化損傷而出現(xiàn)白斑[3]。氫醌也是常見的化學脫色劑，它在酪氨酸酶的作用下被氧化，生成有毒性的半醌基物質，后者使細胞膜發(fā)生脂質過氧化，導致黑素細胞破壞[4]。

近年來，有學者報道使用莫諾苯宗(Monobenzone)誘導的白癜風模型。莫諾苯宗化學名 4-芐氧基苯酚[4-(Benzyloxy)phenol]，是一種酚類化合物，目前用于白癜風的脫色治療。Zhu等[5]將40%的莫諾本宗乳膏局部外用于C57BL/6小鼠皮膚50天后，觀察到小鼠用藥部位出現(xiàn)白斑。在持續(xù)用藥后，小鼠非用藥部位包括軀干、耳朵和(或)尾巴也出現(xiàn)了白斑，且白斑范圍隨著用藥時間的延長而擴大，最終可能覆蓋絕大部分皮膚。由此推測莫諾本宗既有局部毒性作用，又可引發(fā)系統(tǒng)性的免疫反應。皮膚活檢發(fā)現(xiàn)，莫諾本宗可減少局部黑素細胞，并誘導CD8+T細胞增多，這與人類白癜風發(fā)病過程相似。Mansourpour等[6]也報道了40%莫諾本宗外用，6周可以成功誘導小鼠白癜風模型。關于莫諾本宗引發(fā)白癜風的機制，目前文獻報道主要有以下幾個方面：首先，莫諾本宗結構與酪氨酸酶相似，可以競爭性抑制酪氨酸酶的活性，抑制黑素的合成；莫諾本宗可誘發(fā)氧化應激反應并釋放包含黑素體蛋白的外泌體(Exosomes)和熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)，進而活化樹突狀細胞，引發(fā)非特異性免疫反應，導致黑素細胞破壞[7]；還有研究發(fā)現(xiàn)莫諾本宗能導致黑素細胞內質網未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，引起白介素6(interleukin 6, IL-6)和IL-8水平增加，隨后激活自然殺傷細胞(natural killer cells, NK Cells)，導致黑素細胞損傷[8]。本模型在發(fā)病機制和組織學上與人類白癜風非常相似，可用于研究白癜風氧化應激及其與自身免疫之間的聯(lián)系。

表1 主要誘導性白癜風動物模型

2 免疫誘導的白癜風模型

在黑素瘤的治療中，很多患者會出現(xiàn)皮膚色素脫失。這是由于機體免疫細胞在對黑素瘤細胞發(fā)動“免疫攻擊”時，也會識別具有相同抗原的黑素細胞，造成黑素細胞損傷，從而出現(xiàn)皮膚白斑[9]。在對黑素瘤的免疫反應研究中，研究者構建了表達多種黑素細胞特異性抗原的重組牛痘病毒(recombinant Vaccinia Viruses, rVV)。Overwijk等[10]使用表達人酪氨酸酶相關蛋白-1(tyrosinase-related proteins-1，TRP-1)的rVV免疫C57BL/6小鼠，發(fā)現(xiàn)注射后80%的小鼠發(fā)生毛發(fā)變白，且色素脫失與人類黑色素瘤患者使用白介素12(interleukin 12, IL-12)化療后出現(xiàn)的白癜風相似。這一模型與黑素細胞特異性抗體的產生有關，主要依賴CD4+T細胞。還有學者發(fā)現(xiàn)，給小鼠注射抗TRP-1的特異性抗體具有抗腫瘤效果，并會出現(xiàn)色素缺失[11]。Steitz等[12]利用基因槍技術將表達TRP-2的質粒直接導入小鼠皮膚。導入后小鼠皮膚細胞表達TRP-2，且生長的毛發(fā)發(fā)生色素脫失。另外，注射抗TRP-2抗體也可在小鼠誘導色素脫失?；谶@一模型，研究者還利用基因槍技術將表達TRP-2和誘導型熱休克蛋白70(inducible heat shock protein 70, HSP70i)的質粒共同導入小鼠皮膚，出現(xiàn)了色素脫失，而HSP70i敲除的小鼠未出現(xiàn)色素脫失，結構改變的HSP70i在該模型中也不能誘導色素脫失，說明HSP70i對于色素脫失具有重要作用[13]。免疫誘導的白癜風模型可以研究宿主內源性的免疫細胞在色素脫失過程中發(fā)揮的作用，有助于發(fā)現(xiàn)體內導致黑素細胞破壞的免疫因子。這類動物模型還可用于白癜風和黑素細胞腫瘤發(fā)病機制和治療以及二者相關性的研究。

3 轉基因動物模型

TCR是T細胞表面的特異性受體，負責識別由主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)所呈遞的抗原[14]。TCR轉基因動物模型可以體現(xiàn)T細胞介導的自身免疫過程，目前主要有FH小鼠，h3T-A2小鼠和Vitesse小鼠模型以及斑馬魚Nicastrin轉基因模型。

3.1 FH小鼠模型 AAD+轉基因小鼠表達I型MHC分子，其上有人類HLA-A*021的結合位點，并具有酪氨酸酶Tyr369表型。將AAD+小鼠與缺乏酪氨酸酶的白化病小鼠雜交，從這些小鼠中分離出能特異性識別Tyr369的T細胞克隆。利用這些小鼠的TCR基因可以構建一種TCR轉基因小鼠-FH小鼠，F(xiàn)H小鼠的CD8+T細胞能特異性識別Tyr369。將FH小鼠與AAD+小鼠雜交的后代可以出現(xiàn)毛發(fā)及皮膚色素脫失，且免疫組化顯示白斑處有CD8+和CD4+T細胞浸潤。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這一TCR轉基因小鼠模型白斑的發(fā)生依賴IFN-γ和T細胞受體CXCR3 (C-X-C motif chemokine receptor 3)，CCR5 (C-C chemokine receptor 5)，CXCR3和CCR5通過與相應的趨化因子CXCL9，CXCL10 ( C-X-C motif chemokine ligand 9、10)和CCL5 (C-C motif chemokine ligand 5)結合發(fā)揮作用。該小鼠模型在幼年時出現(xiàn)雙側頭面部色素脫失，在生長過程中或成年時才出現(xiàn)軀干色素脫失，而且主要依賴CD8+T細胞，很適合研究細胞因子及相關免疫通路在白癜風中的作用機制[15]。

3.2 h3T-A2 小鼠模型 在黑素瘤的免疫治療中，具有高親和力T細胞受體(T cell receptor, TCR)的T細胞可以對腫瘤細胞產生免疫反應，促進腫瘤的消退。Mehrotra等[16]從黑色素瘤患者的腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL) 中分離出人類白細胞抗原A2(HLA-A2)限制性CD4+T細胞，從中分離出高親和力TCR，然后從HLA-A2+人酪氨酸酶368-376特異性CD4+T細胞系TIL1383I中分離出基因組DNA，以此構建了一個C57BL/6背景的轉基因小鼠：h3T-A2小鼠。這種HLA-A2+/酪氨酸酶雙轉基因小鼠可以早期自發(fā)出現(xiàn)毛發(fā)色素脫失，且色素脫失隨著年齡的增加而加重。作者認為該模型的色素脫失是由于表達TIL 1381I TCR的T細胞對黑素細胞的免疫反應所致。該團隊還分別將h3T-A2 小鼠的IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和穿孔素(perforin)基因敲除，發(fā)現(xiàn)h3T-A2-IFN-γ-/-組的小鼠色素脫失過程明顯受損，而另兩組小鼠則沒有受損，說明IFN-γ在白癜風發(fā)生中具有重要作用。另外，h3T-A2-IFN-γ-/-小鼠比未敲除IFN-γ的小鼠的調節(jié)性T細胞(regulatory cells，Tregs)更多，可用于研究Tregs在白癜風發(fā)病機制中的作用[17]。

3.3 Vitesse小鼠模型 在h3T-A2小鼠模型的基礎上，Eby等[18]先通過設計角蛋白14啟動子(keratin 14-promoter)，得到干細胞因子(stem cell factor，SCF)轉基因 (K14-SCF)小鼠，再將K14-SCF小鼠與h3T-A2小鼠雜交，獲得Vitesse小鼠。Vitesse小鼠可自發(fā)出現(xiàn)皮膚色素脫失，并伴有對稱性的邊界清楚的毛發(fā)變白。另外，該小鼠皮損處的T細胞的白介素-17(IL-17)的表達明顯增加，而Tregs則明顯減少，這與人類白癜風也很相似。但Vitesse小鼠隨著時間的推移逐漸出現(xiàn)復色，且在其他SCF轉基因小鼠模型中也觀察到了復色情況，提示SCF在復色中起作用。Vitesse小鼠具有局部皮膚色素脫失和自發(fā)脫色的特征，很適合用于外用藥治療效果的觀察。

3.4 斑馬魚轉基因模型 除了小鼠之外，斑馬魚與人類的基因具有高度同源性，作為一種新型實驗動物，具有便于實驗操作，世代短，性價比高的特點[19]。Nicastrin是γ-分泌酶(γ-secretase)的四個亞基之一，Nicastrin的缺陷會影響γ-分泌酶的功能和穩(wěn)定性。Hsu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚nicastrinhi1384基因的插入性突變降低了γ-分泌酶的活性，并破壞黑素小體(melanosome)，此突變還會招募吞噬細胞(phagocyte)來吞噬黑素細胞碎片，導致皮膚色素脫失。作者認為，招募吞噬細胞說明Nicastrin參與了皮膚炎癥過程，斑馬魚nicastrinhi1384 基因的插入性突變可能成為皮膚色素脫失性疾病和皮膚炎癥相關性疾病的良好動物模型。

4 外源性T細胞誘導的白癜風模型

白癜風的自身免疫學機制中，T淋巴細胞介導的細胞免疫發(fā)揮了主要作用。移植不同TCR轉基因小鼠的T細胞，來誘導宿主發(fā)生針對黑素細胞的免疫反應，可以誘導白癜風。

Harris等[21]利用一種變異形式的Kit配體在C57BL/6小鼠的基礎上誘導出KRT14-Kitl*4XTG2Bjl 小鼠(簡稱KRT14小鼠)，KRT14小鼠不僅毛發(fā)呈黑色，其表皮也呈黑色，因而更接近人類的皮膚。他們又將表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的DPEGEP小鼠與表達前黑素小體蛋白(premelanosome protein, PMEL)的TCR轉基因小鼠雜交，得到GFP-PMEL TCR轉基因小鼠(簡稱PMEL小鼠)。PMEL小鼠的T細胞表達黑素細胞特異性抗原PMEL的受體，因此可以特異性識別黑素細胞來發(fā)揮免疫效應。Harris等從PMEL小鼠的脾臟中分離出GFP-PMEL CD8+T細胞，然后將其靜脈注射入經過亞致死劑量輻射后的KRT14小鼠體內，這些GFP-PMEL CD8+T細胞通過特異性殺傷作用破壞黑素細胞。注射后5～7周，KRT14小鼠出現(xiàn)皮膚色素脫失，色素脫失多發(fā)生在耳朵、鼻子、掌跖和尾巴部位，皮膚的色素脫失可更好地模擬人類白癜風的發(fā)病過程。另外，通過該模型，他們還發(fā)現(xiàn)在色素脫失區(qū)域的皮膚γ-干擾素(Interferon-γ, IFN-γ)表達增加，阻斷IFN-γ及其下游JAK-STAT(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription)通路可以減少皮膚中CTLs的數(shù)量并阻礙色素脫失過程，提示阻斷IFN-γ相關通路可能成為白癜風治療的新方法。隨后，在Harris鼠模型基礎上進行的JAK激酶抑制劑治療白癜風的動物實驗取得良好的療效[22]，目前JAK抑制劑已經開始人體的臨床試驗[23]。

5 結語

白癜風是一種多因素作用、病因復雜的疾病。適合的、有代表性的動物模型在白癜風發(fā)病機制研究和開發(fā)新療法中發(fā)揮關鍵作用。誘導性白癜風動物模型可以模擬白癜風發(fā)病的不同機制，且動物廉價易得，但應注意因為種屬不同，動物模型還是與人類的發(fā)病過程有所差異。不同模型具有各自的特點，在實際研究中應根據(jù)研究目的選擇合適的動物模型。