基因干擾lncRNA SPRY4-IT1對(duì)GBC-SD細(xì)胞干樣性及線粒體膜電位的影響

李 辰，王慶治，歧紅陽(yáng)，毛建娜，魏小娟，王鵬立，董志超

膽囊癌(gallbladder cancer, GBC)是膽道惡性腫瘤的一種，是全球發(fā)病率排名第五的胃腸道惡性腫瘤。早期GBC患者往往無癥狀，就診時(shí)多為晚期。因此，需要一種新的腫瘤靶標(biāo)，以提高GBC患者的診斷、預(yù)后判斷和治療。近年來，研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNAs)為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在許多人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用?？焖侔l(fā)育生長(zhǎng)因子同源蛋白4內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1(sprouty homolog 4 intronic transcript 1, SPRY4-IT1)為快速發(fā)育生長(zhǎng)因子同源蛋白4(sprouty homolog 4, SPRY4)基因內(nèi)的一個(gè)內(nèi)含子，在各種癌癥中被證明是癌癥發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)樞紐。近期研究表明，lncRNA SPRY4-IT1的上調(diào)與乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌等腫瘤的進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。此外，lncRNA SPRY4-IT1的下調(diào)可抑制膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。然而，尚未見lncRNA SPRY4-IT1對(duì)GBC的影響及作用機(jī)制，該研究通過基因干擾lncRNAs SPRY4-IT1, 探究其對(duì)GBC細(xì)胞GBC-SD腫瘤干細(xì)胞樣特性及線粒體膜電位變化的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶、Lipofectamine 3000試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid，BCA) 蛋白定量試劑盒(美國(guó)PIERCE公司)；Super RT cDNA試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；ELISA BrdU (比色) 試劑盒(瑞士羅氏公司)；Matrigel底膜基質(zhì)(美國(guó)BD公司)；Sry相關(guān)HMG盒2(Sry-related HMG box 2, SOX2)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor 4, OCT4)、CD44、半胱天冬酶3(Caspase-3)、Caspase-9、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2, associated X, Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)、c-Myc抗體(美國(guó)NEB公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (Annexin PE/7-AAD) (南京凱基生物有限公司)；高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；CO培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；電泳槽、電轉(zhuǎn)儀、ChemiDoc XRS 凝膠/發(fā)光圖像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械七廠)；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP(美國(guó)UVP公司)；流式細(xì)胞儀 (美國(guó)Becton-Dickinson公司)；shRNA-SPRY4-IT1(廣州銳博生物有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

GBC-SD細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所有細(xì)胞均在含有5%CO的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，細(xì)胞匯合率達(dá)到85%以上時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將GBC-SD細(xì)胞傳代培養(yǎng)于6孔板中。培養(yǎng)24 h后根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書用Lipofectamine 3000將Scarmble組細(xì)胞轉(zhuǎn)染與shRNA-SPRY4-IT1基因無同源性的shRNA作為陰性對(duì)照，shRNA-SPRY4-IT1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-SPRY4-IT1，48 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.3.2

RT-PCR 使用TRIzol試劑提取總RNA，并通過超微紫外光分光光度計(jì)在260和280 nm處測(cè)定吸光度。按照Super RT cDNA試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，振蕩混勻，短暫離心，使關(guān)閉溶液收集至管底，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件42 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min，短暫離心，冰上冷卻。 此外，使用QuantifastSYBRGreenPCR Kit進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為95 ℃、15 s和60 ℃、60 s。用于該反應(yīng)的引物序列如下：SPRY4-IT1：上游5′-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3′, 下游5′-CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA-3′；GAPDH：上游5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′, 下游5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。

1.3.3

BrdU染色 細(xì)胞增殖測(cè)定采用細(xì)胞增殖ELISA BrdU (比色) 試劑盒根據(jù)說明書轉(zhuǎn)染48 h后，1.0×10個(gè)/孔加入到96孔的培養(yǎng)皿中，并讓其附著過夜。細(xì)胞用BrdU標(biāo)記2 h，固定，用抗BrdU-pod孵育。通過洗滌去除未結(jié)合的過氧化物酶偶聯(lián)物。然后加入底物，15 min后測(cè)量 (370 ～492 nm)吸光度值。

1.3.4

流式細(xì)胞術(shù) 采用Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)GBC-SD細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析和測(cè)量。用不同濃度的二氫楊梅素或二甲基亞砜作對(duì)照，在6孔板中以3×10個(gè)/孔的密度培養(yǎng)48 h。細(xì)胞用冷PBS沖洗3次，然后用100 μl結(jié)合緩沖液處理。然后用3 μl Annexin V-FITC和10 μl 碘化丙啶孵育20 min。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡。

1.3.5

成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞樣特性 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GBC-SD細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基洗1次并重懸，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。在6孔板中加含2% B27、20 ng/ml 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和20 ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)的DMEM/ F12培養(yǎng)基，每孔接種1 000個(gè)細(xì)胞，置于5% CO恒溫培養(yǎng)箱中。每隔2 d補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染shRNA-SPRY4-IT1處理14 d，于倒置顯微鏡下拍照并統(tǒng)計(jì)成球直徑和成球率。

1.3.6

Western blot實(shí)驗(yàn) 使用RIPA裂解緩沖液裂解各組細(xì)胞樣品，在6孔板中每孔加入250 μl裂解液，用槍吹打均勻使細(xì)胞與裂解液充分接觸裂解。然后，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。含有20 mg蛋白質(zhì)的樣品在10%SDS-PAGE中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗 (SOX2, 1∶1 000; OCT4, 1∶1 000; CD44, 1∶1 000; Caspase-3, 1∶1 000; Caspase-9, 1∶1 000; Bax, 1∶1 000; Bcl-2, 1∶1 000; c-Myc, 1∶1 000)于4 ℃封閉過夜，第2天加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL,設(shè)置曝光參數(shù)，檢測(cè)目的條帶對(duì)應(yīng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)弱。

2 結(jié)果

2.1 干擾SPRY4-IT1表達(dá)對(duì)GBC細(xì)胞增殖的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，shRNA-SPRY4-IT1組SPRY4-IT1的表達(dá)水平降低 (

F

=317.6，

P

<0.05) 。見圖1。BrdU染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，shRNA-SPRY4-IT1組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(

F

=83.62，

P

<0.05) 。

2.2 干擾SPRY4-IT1表達(dá)對(duì)GBC細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，3組細(xì)胞凋亡率見圖2A。與對(duì)照組比較，shRNA-SPRY4-IT1組GBC-SD細(xì)胞凋亡率升高 (

F

=60.42，

P

<0.05)。見圖2B。

2.3 干擾SPRY4-IT1表達(dá)對(duì)GBC干細(xì)胞特性的影響

干擾SPRY4-IT1表達(dá)，形成的GBC-SD細(xì)胞微球的體積和數(shù)量減少。見圖3。與對(duì)照組比較，shRNA-SPRY4-IT1組腫瘤干細(xì)胞成球率降低 (

F

=17.84，

P

<0.05)，成球直徑減小(

F

=49.42，

P

<0.05)。見表1。

2.4 干擾SPRY4-IT1表達(dá)對(duì)SOX2、OCT4、CD44的表達(dá)的影響

從Western blot條帶中可以看出，shRNA-SPRY4-IT1組SOX2、OCT4、CD44蛋白表達(dá)量較對(duì)照組降低。見圖4。Western blot灰度分析，與對(duì)照組比較，shRNA-SPRY4-IT1組SOX2、OCT4、CD44蛋白表達(dá)水平均降低(

P

<0.05)。見表2。

圖1 GBC細(xì)胞中SPRY4-IT1的表達(dá)水平以及GBC細(xì)胞的增殖變化

圖2 GBC-SD細(xì)胞的凋亡變化

圖3 成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞樣特性 ×400

表1 各組腫瘤干細(xì)胞成球率和成球直徑的變化

2.5 干擾SPRY4-IT1表達(dá)對(duì)線粒體膜電位的影響

正常GBC-SD細(xì)胞經(jīng)染色后發(fā)出紅色熒光，表示線粒體膜電位完整。與對(duì)照組比較，shRNA-SPRY4-IT1組線粒體膜電位升高 (

F

=230.7，

P

<0.05)。見圖5。

2.6 干擾SPRY4-IT1表達(dá)對(duì)線粒體損傷標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，Western blot條帶顯示，shRNA-SPRY4-IT1組cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)量較對(duì)照組升高；Bcl-2和c-Myc蛋白表達(dá)量較對(duì)照組降低。Western blot灰度分析結(jié)果見表3，與對(duì)照組比較，shRNA-SPRY4-IT1組cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平均升高(

P

<0.05)；c-Myc蛋白表達(dá)水平降低(

P

<0.05)。

圖4 不同組SOX2、OCT4、CD44蛋白表達(dá)量

圖5 不同組GBC細(xì)胞線粒體膜電位變化

表2 不同組SOX2、OCT4、CD44蛋白表達(dá)水平變化

表3 不同組Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、c-Myc蛋白表達(dá)水平變化

圖6 不同組Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、c-Myc的蛋白表達(dá)量

3 討論

lncRNAs是ncRNAs家族中重要的新成員，被認(rèn)為是與癌癥進(jìn)展相關(guān)的各種腫瘤的關(guān)鍵介質(zhì)。研究顯示lncRNA在促進(jìn)人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分布和癌癥轉(zhuǎn)移。最近一項(xiàng)研究報(bào)道稱，SPRY4-IT1在GBC組織中高表達(dá)，SPRY4-IT1對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用部分與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)。但是干擾SPRY4-IT1表達(dá)在GBC中的功能作用尚未被闡明。在本研究中，通過基因干擾lncRNAs SPRY4-IT1來研究其對(duì)GBC細(xì)胞GBC-SD腫瘤干細(xì)胞樣特性及線粒體膜電位變化的影響。

細(xì)胞增殖是惡性腫瘤細(xì)胞具有無限增殖能力的關(guān)鍵因素。同樣，在GBC的研究中，Yang et al研究發(fā)現(xiàn)在GBC組織中SPRY4-IT1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明SPRY4-IT1的下調(diào)抑制了GBC細(xì)胞的增殖。與Yang et al研究結(jié)果一致，本研究顯示干擾SPRY4-IT1表達(dá)后，綠色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，表明干擾SPRY4-IT1表達(dá)能抑制GBC細(xì)胞GBC-SD的增殖。

lncRNASPRY4-IT1從SPRY4基因的第2個(gè)內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。線粒體膜去極化引起的線粒體膜電位的下降，在凋亡信號(hào)的刺激下，線粒體膜電位的下降必然引起凋亡。本研究顯示干擾SPRY4-IT1表達(dá)，線粒體膜電位降低，表明干擾SPRY4-IT1表達(dá)可誘導(dǎo)GBC細(xì)胞凋亡。c‐MYC癌基因是在包括GBC在內(nèi)的人類癌癥發(fā)展過程中最常見的激活癌基因之一。在凋亡過程中，細(xì)胞色素C是凋亡小體形成所必需的，并由此激活procaspase-9，而procaspase-9又裂解并激活下游效應(yīng)因子Caspase-3，進(jìn)而導(dǎo)致最終的細(xì)胞凋亡。Yao et al研究發(fā)現(xiàn)敲除SPRY4-IT1、Bcl-2的蛋白表達(dá)受到抑制，Caspase-3、Caspase-9、Bax的蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)PDAC細(xì)胞的凋亡。本研究顯示干擾SPRY4-IT1表達(dá)引起c-Myc蛋白表達(dá)水平降低；促進(jìn)GBCGBC-SD細(xì)胞凋亡，增高cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)，表明干擾SPRY4-IT1表達(dá)可調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)GBC細(xì)胞凋亡。

干細(xì)胞被認(rèn)為是少數(shù)幾個(gè)具有失控增殖特征的癌細(xì)胞之一，包括自我更新、多潛能分化和干細(xì)胞特征。CD44是腫瘤的細(xì)胞表面標(biāo)志物，被用來識(shí)別腫瘤干細(xì)胞，這些腫瘤干細(xì)胞已被證明在腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后中起重要作用。OCT4與胚胎干細(xì)胞和生殖細(xì)胞中觀察到的多能性、增殖潛能和自我更新特性有關(guān)。SOX2對(duì)胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)前提細(xì)胞的自我更新維持至關(guān)重要。研究表明SOX2在許多惡性腫瘤中過表達(dá)，并與腫瘤的分化和進(jìn)展相關(guān)。此外，SOX2蛋白與OCT4結(jié)合，調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄和干細(xì)胞特性，兩者在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用，對(duì)胚胎發(fā)生以及細(xì)胞的多能性和自我更新至關(guān)重要。然而，腫瘤干細(xì)胞在GBC中的作用尚無研究。本研究顯示干擾SPRY4-IT1表達(dá)減小腫瘤成球直徑，降低腫瘤干細(xì)胞成球率以及SOX2、OCT4、CD44蛋白表達(dá)水平，表明干擾SPRY4-IT1表達(dá)能降低腫瘤干細(xì)胞特性，抑制GBC的發(fā)展，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。