淫羊藿苷介導(dǎo)Nrf2/HO-1信號通路減輕大鼠腎缺血再灌注損傷和氧化應(yīng)激

牟俊杰，馮 靜，張文松，關(guān) 欣，陳 琴，蔣飛飛，甘 措，劉 瑤，鄧 菲

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是全球范圍內(nèi)急性期死亡和殘疾的常見原因之一，給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了重大的疾病負(fù)擔(dān)。腎缺血再灌注是急性腎損傷的主要原因，通過影響各種細(xì)胞因子的炎癥活性和活性氧的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡加劇腎臟損害。隨著腎臟缺血再灌注的重要性越來越明顯，開發(fā)新的治療方法來預(yù)防缺血再灌注引起的腎臟損害非常有必要。

淫羊藿苷是中藥淫羊藿的主要活性成分，具有抗腫瘤、改善心腦血管、促進(jìn)骨組織功能、提高免疫等作用。相關(guān)研究表明，淫羊藿苷可通過對抗氧化應(yīng)激或抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)酶表達(dá)及其下游的炎癥級聯(lián)反應(yīng)改善腎臟缺血再灌注損傷。但淫羊藿苷對腎缺血再灌注損傷的具體作用分子仍尚不清楚。該文旨在探究淫羊藿苷對腎缺血再灌注大鼠病理損傷和氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60只SD大鼠購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，雄性，7周齡，體質(zhì)量(210±12)g，許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。置于12 h/12 h明暗循環(huán)動物設(shè)施中常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和主要試劑

淫羊藿苷(110737-201516)購自中國食品藥品檢定研究院，化學(xué)式：C33H40O15，分子量：676.65，純度≥94.2%。蘇木精-伊紅染液(D006-1-1)、尿蛋白定量測試盒(C035-2-1)、肌酐測定試劑盒(C011-2-1)、尿素氮測試盒(C013-2-1)、總超氧化物歧化酶測定試劑盒(A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒(A005-1-2)購自南京建成生物工程研究所；iNOS ELISA試劑盒(JK-a-1607)、IL-10 ELISA試劑盒(JK-a-5026)購自上海晶抗生物工程有限公司；Anti Caspase-3(ab13847)、cleaved Caspase-3(ab2302)、Caspase-9(ab52298)、cleaved Caspase-9(ab2324)、Bax(ab53154)、Bcl-2(ab196495)、Nrf2(ab31163)、p-Nrf2(ab76026)、HO-1(ab13243)、GAPDH(ab9485)購自英國Abcam公司。

1.3 動物模型建立與分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為5組：Control組、RIRI組、RIRI+icariin 25 mg/kg組、RIRI+icariin 50 mg/kg組和RIRI+icariin 100 mg/kg組，每組12只。參照Zhang et al方法建立腎缺血再灌注大鼠模型，麻醉所有大鼠，對所有大鼠進(jìn)行中線剖腹手術(shù)和右腎切除術(shù)，暴露左腎，Control組不做處理，其余各組用非創(chuàng)傷性血管鉗夾緊左腎動脈，誘導(dǎo)缺血1 h，松開動脈后，再灌注24 h?？p合切口后RIRI+icariin 25 mg/kg組、RIRI+icariin 50 mg/kg組和RIRI+icariin 100 mg/kg組分別灌胃淫羊藿苷25、50、100 mg/kg，Control組和RIRI組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d，7 d后處死各組大鼠。

1.4 腎功能指標(biāo)

收集各組大鼠尿液、血液，用全自動生化分析儀檢測尿液中蛋白尿含量，用分離后的血清用全自動生化分析儀檢測肌酐酸、尿素氮水平。

1.5 HE染色

取各組大鼠腎組織先用10%甲醛固定48 h，然后石蠟包埋制作呈切片，切片5 mm厚。然后用蘇木精-伊紅染色。在400×熒光顯微鏡下觀察腎組織損傷情況。

1.6 ELISA檢測外周血和腎組織中iNOS、IL-10含量

按照iNOS、IL-10 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行雙抗夾心酶聯(lián)免疫法檢測，在4 ℃下用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，100 μl/孔到96孔酶標(biāo)板，將抗原包被過夜，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加150 μl 1%BSA封閉1 h，PBST洗滌3次，加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌5次，加入100 μl稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次后顯色劑顯色20 min，于450 nm處酶標(biāo)儀測定吸光度(optical density,OD)。

1.7 氧化應(yīng)激指標(biāo)

按照試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測定總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量，采用可見分光光度計測定谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione，GSH)含量。SOD在450 nm處測OD值，GSH在412 nm處測OD值。

1.8 Western blot

收集各組大鼠腎組織細(xì)胞并在冰上溶解25 min。用BCA試劑盒提取總蛋白并測定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品，100 ℃變性5 min。SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在4 ℃條件下加入相應(yīng)一抗并孵育過夜，清洗，然后在4 ℃下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷降低腎缺血再灌注大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平

通過試劑盒檢測各組大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平，結(jié)果如圖1所示，與Control組比較，RIRI組大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平升高(

t

=1.571、1.941、1.813，

P

<0.05)。與RIRI組比較，RIRI+icariin 50、100 mg/kg組大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平降低(

F

=16.67、9.882、11.79，

P

<0.05)。

圖1 淫羊藿苷對腎缺血再灌注大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平的影響

圖2 淫羊藿苷對腎缺血再灌注大鼠病理損傷程度的影響 HE染色×400

2.2 淫羊藿苷改善腎缺血再灌注大鼠病理損傷程度

通過HE染色檢測各組大鼠腎組織病理損傷結(jié)果。如圖2所示，Control組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)和腎小球細(xì)胞形態(tài)均未見異常，RIRI組和RIRI+icariin 25 mg/kg組腎組織病理改變明顯，腎小球數(shù)量減少，腎小管水腫、擴(kuò)張，空泡化，炎性細(xì)胞浸潤，纖維化，細(xì)胞充血，部分區(qū)域可見蛋白管型，表現(xiàn)出明顯的腎組織病理損傷；RIRI+icariin 50、100 mg/kg組較RIRI組病理損傷程度明顯改善。

2.3 淫羊藿苷降低腎缺血再灌注大鼠cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/ Caspase-9、Bax/Bcl-2比值

Western blot檢測各組大鼠腎組織Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖3所示，與Control組比較，RIRI組cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/ Caspase-9、Bax/Bcl-2比值升高(

t

=1.000、1.091、1.009，

P

<0.05)。與RIRI組相比較，RIRI+icariin 50、100 mg/kg組cleaved Caspase-3/ Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2比值降低(

F

=124.5、38.05、272.6，

P

<0.05)。

2.4 淫羊藿苷降低腎缺血再灌注大鼠外周血和腎組織中iNOS含量，升高IL-10含量

通過ELISA檢測外周血和腎組織中iNOS、IL-10含量，結(jié)果如圖4所示，與Control組比較，RIRI組外周血和腎組織中iNOS、IL-10含量升高(

t

=1.320、3.400、1.288、3.667，

P

<0.05)。與RIRI組比較，RIRI+icariin 50、100 mg/kg組iNOS含量降低(

F

=11.50、18.50，

P

<0.05)，IL-10含量升高(

F

=16.00、22.14，

P

<0.05)。

2.5 淫羊藿苷升高腎缺血再灌注大鼠SOD、GSH含量和Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平

通過試劑盒檢測各組大鼠腎組織SOD和血清GSH含量結(jié)果，如圖5所示，與Control組比較，RIRI組SOD、GSH含量降低(

t

=3.600、1.960，

P

<0.05)。與RIRI組比較，RIRI+icariin 50、100mg/kg組SOD、GSH含量升高(

F

=4.425、10.99，

P

<0.05)；Western blot檢測各組大鼠Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖5所示，與Control組比較，RIRI組p-Nrf2/ Nrf2比值和HO-1蛋白水平降低(

t

=1.118、1.048，

P

<0.05)。與RIRI組比較，RIRI+icariin 50、100mg/kg組p-Nrf2/ Nrf2比值和HO-1蛋白水平升高(

F

=22.62、50.36，

P

<0.05)。

圖3 淫羊藿苷對腎缺血再灌注大鼠Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

腎缺血再灌注會造成嚴(yán)重的腎損傷，如腎小球?yàn)V過率降低，腎小管上皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致腎小管的重吸收作用減弱。腎缺血再灌注損傷臨床表現(xiàn)為血肌酐和尿素氮升高,其次腎臟損傷往往伴隨著蛋白尿的產(chǎn)生。本研究表明淫羊藿苷具有降低腎缺血再灌注大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平的作用，提示淫羊藿苷通過改善腎功能改善腎缺血再灌注損傷。

圖4 淫羊藿苷對腎缺血再灌注大鼠外周血和腎組織中iNOS、IL-10含量的影響

細(xì)胞凋亡是一種由多種基因調(diào)控的自主程序性死亡。細(xì)胞凋亡在腎缺血再灌注損傷病理生理過程中發(fā)揮重要作用，抑制細(xì)胞凋亡是治療腎缺血再灌注損傷重要方式。Caspase家族成員是哺乳動物細(xì)胞凋亡的主要蛋白酶家族，在細(xì)胞接收凋亡信號后，Caspases凋亡級聯(lián)被激活，Caspase-9為凋亡啟動因子，位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)上游，在其他蛋白參與下發(fā)生自我活化并激活下游凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bax和Bcl-2屬于Bcl-2基因家族成員，Bcl-2為凋亡抑制基因，Bax為促凋亡基因，Bax/Bcl-2比值越高，凋亡狀況越嚴(yán)重。朱敏杰 等研究發(fā)現(xiàn)葛根素通過降低Caspase-3蛋白表達(dá)，降低Bax/Bcl-2比值抑制腎缺血再灌注大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡、改善腎功能。本文研究顯示淫羊藿苷具有降低腎缺血再灌注大鼠cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/ Caspase-9、Bax/Bcl-2比值的作用。提示淫羊藿苷通過抑制細(xì)胞凋亡改善腎功能。

圖5 淫羊藿苷對腎缺血再灌注大鼠SOD、GSH含量和Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平的影響

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腎缺血再灌注損傷的重要因素，通過施用藥物干預(yù)炎癥因子的釋放和抗氧化應(yīng)激可有效改善腎缺血再灌注損傷。IL-10是內(nèi)源性抗炎因子，研究表明IL-10在腎缺血再灌注損傷中含量降低，導(dǎo)致大量炎癥因子的釋放。iNOS通過催生NO與氧自由基結(jié)合成亞硝酸鹽，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化、壞死、凋亡和炎癥因子的釋放，導(dǎo)致組織損傷加重。SOD和GSH是體內(nèi)抗氧化作用的防御系統(tǒng)，當(dāng)氧自由基大量產(chǎn)生時，SOD和GSH消耗用以清除自由基，導(dǎo)致體內(nèi)SOD和GSH含量降低，SOD和GSH的含量反應(yīng)幾天受氧自由基的損傷程度。本研究顯示淫羊藿苷具有降低腎缺血再灌注大鼠外周血和腎組織中iNOS含量，升高IL-10含量，升高腎缺血再灌注大鼠SOD、GSH含量的作用。提示淫羊藿苷通過抑制炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激改善腎缺血再灌注損傷。

核因子-E2相關(guān)因子2是內(nèi)源性抗氧化防御的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，可以促進(jìn)多種抗氧化基因轉(zhuǎn)錄，包括血紅素氧化酶-1。相關(guān)研究表明Nrf2/HO-1信號通路是改善腎損傷的重要通路。Long et al研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸通過激活Nrf2通路，發(fā)揮抗氧化和抗炎作用，從而改善腎缺血再灌注引發(fā)的急性腎損傷。本研究顯示淫羊藿苷具有升高Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平的作用。提示淫羊藿苷通過介導(dǎo)Nrf2/HO-1信號通路改善腎缺血再灌注損傷。

綜上，淫羊藿苷在腎缺血再灌注損傷中有明顯的抗氧化作用，可抑制炎癥因子的釋放，抑制細(xì)胞凋亡，改善腎功能，可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路實(shí)現(xiàn)的。本研究為淫羊藿苷臨床應(yīng)用治療腎缺血再灌注損傷提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。