ASH2L在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其對SKOV-3細(xì)胞系增殖的影響

孫 超，孫士瑩，詹 磊，衛(wèi) 兵，王文艷

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤，死亡率位于婦科惡性腫瘤首位。表觀遺傳學(xué)的研究對惡性腫瘤的預(yù)防和治療有著重要的意義。有研究表明：組蛋白H3K4甲基化修飾可影響腎癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌及胃癌等多種惡性腫瘤的預(yù)后。在哺乳動物體內(nèi)，混合譜系白血病(mixed lineage leukemia，MLL)甲基轉(zhuǎn)移酶能夠參與家族蛋白調(diào)節(jié)H3K4的組蛋白修飾，而ASH2L是MLL甲基轉(zhuǎn)移酶的核心亞單位之一。ASH2L 的表達(dá)缺失，會使MLL復(fù)合體進(jìn)行H3K4三甲基化修飾的水平降低。因此,ASH2L的表達(dá)會通過甲基化修飾的途徑影響細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展及癌變。目前尚無關(guān)于ASH2L在卵巢癌中的相關(guān)性研究，該研究旨在觀察ASH2L在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其對卵巢上皮性惡性腫瘤SKOV-3增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細(xì)胞系 人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3及人腎上皮細(xì)胞系293T(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，保存于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞系用含有10%的胎牛血清、1%鏈霉素及青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO和飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.1.2

標(biāo)本收集 選取2018年3月—2019年7月因卵巢癌和同期因絕經(jīng)后子宮良性疾病在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科行手術(shù)治療的20例患者為研究對象。卵巢癌患者10例，因子宮良性疾病行子宮雙附件切除的患者10例(子宮肌瘤患者6例，子宮腺肌癥患者3例，子宮內(nèi)膜息肉1例)。卵巢癌組患者手術(shù)前均未接受輔助化療；絕經(jīng)后子宮良性疾病組患者術(shù)前未接受性激素治療。卵巢癌組患者年齡為42～65(52±6.62)歲；子宮良性疾病組患者年齡為50～58(53±2.63)歲。卵巢癌組術(shù)后卵巢組織病理均為卵巢漿液性乳頭狀腺癌。子宮良性疾病組患者術(shù)后卵巢病理結(jié)果均提示卵巢正常。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會同意。

1.1.3

感受態(tài)細(xì)胞 DH5α(上海生工生物工程股份有限公司)保存于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱中。

1.1.4

主要試劑 ASH2L抗體(美國BETHYL公司)；β-actin多克隆抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、ECL發(fā)光試劑盒(美國affinity公司)；PVDF膜(上海Biosharp公司)；胎牛血清、高糖DMEM液體培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；免疫組化試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)；ASH2L質(zhì)粒及空載質(zhì)粒(美國Addgene公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)；jetPRIME?試劑(法國polyplus-transfection公司)；CCK-8試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)。

1.1.5

主要儀器 Heraeus CO恒溫培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)；高速低溫離心機(jī)(美國Eppendorf公司)；CU420型電熱恒溫水箱(上海恒科儀器有限公司)；電泳儀、顯影儀(上海天能科技有限公司)；IMPLEN超微量分光光度計(江蘇萬科科教儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1

免疫組化 收集上皮性卵巢癌組織，制成石蠟切片并脫蠟，放入修復(fù)盒中浸潤于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液，在微波爐內(nèi)加溫抗原修復(fù)，使用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性的過氧化物酶，血清封閉后加入一抗，復(fù)溫后加入對應(yīng)的二抗，室溫下孵育50 min，滴加鏈親和素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min,加入現(xiàn)配的DAB染液，避光約10 min后顯微鏡觀察染色情況。

1.2.2

Western blot實(shí)驗(yàn) 提取組織或細(xì)胞系的總蛋白，利用BCA法進(jìn)行蛋白定量，在制好的凝膠板孔中加入樣品和Marker，而后依次進(jìn)行電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜過后，對帶有蛋白的PVDF條帶依次進(jìn)行室溫下5%脫脂牛奶封閉、洗膜，4 ℃下一抗過夜孵育、洗膜，室溫下二抗封閉1 h、洗膜，最后利用顯影儀進(jìn)行ECL顯色，并對圖像進(jìn)行處理與分析。

1.2.3

轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒擴(kuò)增 將質(zhì)粒樣本加入到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，接種于LB培養(yǎng)基中并于37 ℃過夜培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中挑取單克隆菌落放入含抗生素的LB培養(yǎng)液中37 ℃、200～250 r/min條件下過夜搖菌培養(yǎng)，最后利用質(zhì)粒提取試劑盒對菌液中的質(zhì)粒進(jìn)行提取，并測量濃度。

1.2.4

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 當(dāng)6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞覆蓋率滿意時，以質(zhì)粒懸液：緩沖液：jetPRIME?試劑=1∶100∶2的比例配制轉(zhuǎn)染混合物，并孵育10～15 min，將6孔板中的培養(yǎng)基清洗并更新，孵育結(jié)束后將轉(zhuǎn)染混合物加入其中，置于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中，24 h后更換培養(yǎng)基，并繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，留用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5

CCK-8實(shí)驗(yàn) 在細(xì)胞系轉(zhuǎn)染后的24、48、72 h分別對6孔板中的各組細(xì)胞進(jìn)行消化，并計數(shù)。將適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液接種于96孔板中(100 μl/孔)，另有孔加入相應(yīng)量不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對照。待細(xì)胞貼壁后，將10 μl的CCK-8溶液加入到孔中，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,經(jīng)過酶標(biāo)儀450 nm處測量吸光度的值，反復(fù)測量3次，取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測ASH2L在細(xì)胞中的表達(dá)定位

在上皮性卵巢癌組織中，ASH2L的表達(dá)定位于細(xì)胞核中(圖1)。

圖1 卵巢組織免疫組化染色

2.2 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測組織中ASH2L蛋白的表達(dá)

提取組織的總蛋白，Western blot方法檢測上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織中ASH2L蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示：上皮性卵巢癌組織的ASH2L蛋白表達(dá)水平高于正常卵巢組織(圖2)，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.01)。

圖2 Western blot法檢測各組組織中蛋白表達(dá)情況

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞系中ASH2L蛋白的表達(dá)

分別培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3及人腎上皮細(xì)胞系293T，提取兩種細(xì)胞系的總蛋白，Western blot方法檢測SKOV-3和293T細(xì)胞系中ASH2L蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示：SKOV-3細(xì)胞系中ASH2L蛋白的表達(dá)水平高于293T細(xì)胞(圖3)，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。

圖3 Western blot法檢測細(xì)胞系中蛋白表達(dá)情況

2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細(xì)胞系的增殖情況

對SKOV-3細(xì)胞分別進(jìn)行ASH2L質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，采用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后ASH2L蛋白的表達(dá)量，驗(yàn)證SKOV-3細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的SKOV-3細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染ASH2L質(zhì)粒的SKOV-3細(xì)胞中ASH2L蛋白明顯高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.01，圖4)。在SKOV-3成功轉(zhuǎn)染后的24、48、72 h，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染ASH2L質(zhì)粒的SKOV-3細(xì)胞對比研究，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后24、48和72 h，ASH2L轉(zhuǎn)染組較空載轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖能力均有所增加，且兩組間的細(xì)胞增殖差異隨時間的延長逐漸增加(圖5)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.01)。

圖4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞蛋白表達(dá)情況

圖5 CCK-8檢測細(xì)胞系增殖情況

3 討論

研究指出：血清中游離甲基化DNA的表達(dá)水平可以反映腫瘤組織的增生狀態(tài)，可作為腫瘤早期診斷的標(biāo)志物之一，而多重巢式特異性甲基化PCR檢測可作為潛在的上皮性卵巢癌早期診斷的方法之一。

DNA的不同修飾可以使染色體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致基因表達(dá)以及細(xì)胞行為的改變。在人類腫瘤基因圖譜的研究中：哺乳動物蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶即MLL復(fù)合物的家族特異性基因異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)。MLL酶以腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移至組蛋白H3K4e-氨基上，完成H3K4的甲基化修飾，可分為MLL和SETI A/B兩類甲基化酶。MLL復(fù)合物的核心蛋白包括WDR5、RbBP5、ASH2L及DPY30。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)：敲除MLL復(fù)合物中的ASH2L核心蛋白，可導(dǎo)致MLL復(fù)合物酶活性的降低。

有文獻(xiàn)表明，腫瘤細(xì)胞增殖過程中有ASH2L的參與：癌蛋白MYC可與ASH2L發(fā)生相互作用；乳腺癌、胰腺癌、喉癌肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌及皮膚黑色素瘤等腫瘤中均存在ASH2L的高表達(dá)；Qi et al的研究表明，乳腺癌標(biāo)本及相關(guān)癌細(xì)胞系內(nèi)，存在ASH2L的高表達(dá)，且ASH2L的表達(dá)水平與ERα相關(guān)；Cheng et al研究顯示，肺癌的惡性程度受MMP9和ASH2L的表達(dá)水平調(diào)控，抑制ASH2L的表達(dá)可以有效促進(jìn)MMP9介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的浸潤和遷移。ASH2L蛋白表達(dá)通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制間接地影響著惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，該研究表明ASH2L在上皮性卵巢癌中表達(dá)升高，高表達(dá)的ASH2L可促進(jìn)卵巢上皮性腫瘤細(xì)胞SKOV-3的增殖，這表明ASH2L與卵巢癌同樣有著密切的聯(lián)系，參與它的發(fā)生發(fā)展，而其中的具體機(jī)制還需要將來更多的思考和實(shí)驗(yàn)來探索。