鹽誘導(dǎo)激酶1過(guò)表達(dá)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠肝臟脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)機(jī)制

周 璞，付 薇，謝凌波，李 倩，鄧稀予

肥胖作為一種最常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)障礙性疾病，與多種疾病關(guān)系密切。目前肝臟中脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)與營(yíng)養(yǎng)性肥胖的關(guān)系是研究熱點(diǎn)之一。鹽誘導(dǎo)激酶1(salt-inducible kinase 1，SIK1)是AMPK家族的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能在肝、腎、脂肪及心臟等多種組織中表達(dá)，具有廣泛的生理作用，其中對(duì)哺乳動(dòng)物糖尿病相關(guān)的糖脂代謝和高血壓相關(guān)的水鹽代謝平衡的調(diào)節(jié)作用是目前的研究熱點(diǎn)。有研究提示，SIK1能夠調(diào)節(jié)生酯基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-c(sterol regulatory element binding protein-c，SREBP-1c)的表達(dá)及活性，進(jìn)而調(diào)控肝臟中脂肪酸和三酰甘油(triglycerides，TG)合成來(lái)參與到脂質(zhì)代謝中。雖然目前已經(jīng)證實(shí)SIK1能夠調(diào)控脂質(zhì)的合成，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚，該研究通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠，并通過(guò)尾靜脈注射SIK1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，來(lái)研究SIK1調(diào)控肥胖大鼠肝臟脂代謝紊亂的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠40只，3周齡，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院[許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0013]，所有SD大鼠均飼養(yǎng)在中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院屏障環(huán)境動(dòng)物房[SYXK(京)2014-0033]，培育室溫度20～25 ℃，濕度保持在65%～70%，進(jìn)行人工光照(12 h/12 h晝夜)，大鼠全天自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器

高脂飼料(2.5%膽固醇、0.3%膽酸鈉、20%蔗糖、20%豬油、57.2%標(biāo)準(zhǔn)飼料)購(gòu)自北京阜康生物科技股份有限公司；慢病毒載體系統(tǒng)由pLenti-CMV-EGFP載體、psPAX2(gap/poly元件)載體、pMD2.G(VSVG元件)載體三質(zhì)粒組成，購(gòu)自上海泰冷生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELASE)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170104、20170125、20170108、20170115；兔抗大鼠cleaved caspase-3、caspase-3、cleaved caspase-9、caspase-9、SREBP-1c、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC1)、β-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。Olympus BX60光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；生化7100型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCP-31C型電泳槽(北京六一儀器廠(chǎng))；JS-300凝膠圖像分析儀(上海培清科技公司)。

1.3 建模、分組及處理方式

參考文獻(xiàn)方法，將40只SD大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組(Control組)10只和建模組30只，適應(yīng)性常規(guī)飼料喂養(yǎng)1周后，建模組大鼠改用高脂飼料喂養(yǎng)12周，Control組大鼠繼續(xù)常規(guī)飼料喂養(yǎng)，以高脂飼養(yǎng)組大鼠體質(zhì)量超過(guò)原體質(zhì)量的20%為造模成功；建模組中共24只大鼠造模成功，隨機(jī)均分為Obesity組、Obesity+LV組、Obesity+LV-SIK1組，Obesity+LV組大鼠和Obesity+LV-SIK1組大鼠分別通過(guò)尾靜脈注射空白質(zhì)粒(33.3 μl/只)和SIK1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(33.3 μl/只)(質(zhì)粒的構(gòu)建以及測(cè)序均委托深圳華大基因科技服份有限公司完成)，Obesity組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。Obesity+LV組、Obesity+LV-SIK1組均有2只轉(zhuǎn)染失敗，剩下的大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)8周。

1.4 樣本采集

完成處理后檢測(cè)各組大鼠體質(zhì)量，之后饑餓過(guò)夜，次日采取尾靜脈空腹血，分離血清，-20 ℃條件下保存待測(cè)；10%水合氯醛麻醉后斷頭處死大鼠，取各組大鼠肝右側(cè)相同部分的肝組織，分為2部分：一部分用10%的甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、包埋、脫蠟后制成切片，用于HE染色；另一部分則取出進(jìn)行速凍，形成凍塊后，涂上一層OCT包埋膠，并利用恒溫冰凍切片機(jī)切成薄片，用于油紅O染色觀(guān)察。另取部分肝組織放入液氮中迅速冷凍，并保存在-80 ℃環(huán)境下待測(cè)。

1.5 肝功能指標(biāo)及脂代謝生化指標(biāo)水平的檢測(cè)

利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量各組大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)水平、總膽固醇(total cholesterol，TC)、TG、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。每組測(cè)量重復(fù)3次，取平均值。

1.6 炎癥細(xì)胞因子水平的檢測(cè)

取1.4中各組大鼠血清，由專(zhuān)業(yè)的檢驗(yàn)人員按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行TNF-α、iNOS、IL-6、IL-10水平的檢測(cè)。每組測(cè)量重復(fù)3次，取平均值。

1.7 HE染色觀(guān)察肝組織病理變化

取1.4中制備好的肝組織切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，利用Olympus光學(xué)顯微鏡觀(guān)察肝組織結(jié)構(gòu)排列及病理?yè)p傷情況。

1.8 油紅O染色觀(guān)察肝組織中脂肪堆積

取1.4中制好的冰凍切片，參考文獻(xiàn)方法，將切片組織裱貼于載玻片，待切片恢復(fù)室溫后，用蒸餾水浸洗2 s，繼續(xù)用60%異丙醇浸洗2 s，油紅O染液浸染10 min，60%異丙醇浸染分色2 s，蒸餾水洗1 s，HE復(fù)染2 min，流水洗10 min，蒸餾水洗2 s后用濾紙吸干切片周?chē)?，水溶性封片劑封固并在蓋玻片與載玻片交界邊緣用中性樹(shù)膠封閉。在Olympus光學(xué)顯微鏡觀(guān)察肝細(xì)胞脂肪變情況。

1.9 Western blot法檢測(cè)肝組織中凋亡以及生酯基因蛋白表達(dá)

取1.4中凍存的肝組織50 mg，提取肝組織中的總蛋白后采用BCA法測(cè)量蛋白濃度，每組樣品取等量蛋白50 μg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過(guò)的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗大鼠一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL發(fā)光液將PVD膜顯色，暗室曝光到X線(xiàn)片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參積分吸光度值比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)SIK1對(duì)肥胖大鼠體質(zhì)量及肝功能指標(biāo)的影響

與Control組相比，Obesity組大鼠體質(zhì)量及ALT、AST水平升高(

P

<0.05)，與Obesity組相比，Obesity+LV組大鼠體質(zhì)量及ALT、AST水平無(wú)顯著變化(

P

>0.05)，Obesity+LV-SIK1組大鼠體質(zhì)量及ALT、AST水平降低(

P

<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及ALT、AST水平比較

2.2 過(guò)表達(dá)SIK1對(duì)肥胖大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影響

與Control組相比，Obesity組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平升高(

P

<0.05)，HDL-C水平降低(

P

<0.05)；與Obesity組相比，Obesity+LV組大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平無(wú)明顯變化(

P

>0.05)，Obesity+LV-SIK1組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(

P

<0.05)，HDL-C水平升高(

P

<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 過(guò)表達(dá)SIK1對(duì)肥胖大鼠外周血TNF-α、iNOS、IL-6、IL-10水平的影響

與Control組相比，Obesity組大鼠外周血中TNF-α、iNOS、IL-6、IL-10水平升高(

P

<0.05)；與Obesity組相比，Obesity+LV組大鼠外周血中TNF-α、iNOS、IL-6、IL-10水平無(wú)明顯變化(

P

>0.05)，Obesity+LV-SIK1組大鼠外周血中TNF-α、iNOS、IL-6水平降低(

P

<0.05)，IL-10水平升高(

P

<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 過(guò)表達(dá)SIK1對(duì)肥胖大鼠肝組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果(圖1)顯示,Control組大鼠肝組織中肝臟細(xì)胞形態(tài)大小一致，分界清晰，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀整齊排列；Obesity組和Obesity+LV組大鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肝細(xì)胞高度氣球樣變，并出現(xiàn)大氣泡為主的脂肪變性；Obesity+LV-SIK1組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂程度降低，氣球樣變程度減低，僅可見(jiàn)少量小泡性脂肪變性。

2.5 過(guò)表達(dá)SIK1對(duì)肥胖大鼠肝組織中caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，Obesity組大鼠肝組織中cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9表達(dá)水平升高(

P

<0.05)；與Obesity組相比，Obesity+LV組大鼠肝組織中cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9表達(dá)水平無(wú)明顯變化(

P

>0.05)，Obesity+LV-SIK1組大鼠肝組織中cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9表達(dá)水平降低(

P

<0.05)。見(jiàn)圖2。

表2 各組大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的比較

表3 各組大鼠外周血中TNF-α、iNOS、IL-6、IL-10水平的比較

圖1 各組大鼠肝組織病理變化 HE染色 ×200A：Control組；B：Obesity組；C：Obesity+LV組；D：Obesity+LV-SIK1組

圖2 各組大鼠肝組織中caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)水平比較

2.6 過(guò)表達(dá)SIK1對(duì)肥胖大鼠肝組織中脂肪堆積的影響

油紅O染色結(jié)果(圖3)顯示，Control組大鼠肝細(xì)胞中只看得見(jiàn)細(xì)胞核染成的藍(lán)色，未見(jiàn)橘紅色脂滴；Obesity組和Obesity+LV組大鼠肝組織中可見(jiàn)大量橘紅色脂滴，且藍(lán)色細(xì)胞核滴量減少；Obesity+LV-SIK1組大鼠肝組織中僅可見(jiàn)極少量的橘紅色脂滴，并且藍(lán)色細(xì)胞核滴量增加。

2.7 過(guò)表達(dá)SIK1對(duì)肥胖大鼠肝組織中生酯基因蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，Obesity組大鼠肝組織中SREBP-1c、FASN、ACC1蛋白的表達(dá)水平升高(

P

<0.05)；與Obesity組相比，Obesity+LV組大鼠肝組織中SREBP-1c、FASN、ACC1蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化(

P

>0.05)，Obesity+LV-SIK1組大鼠肝組織中SREBP-1c、FASN、ACC1蛋白的表達(dá)水平降低(

P

<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖3 各組大鼠肝細(xì)胞油紅O染色結(jié)果 ×200

圖4 各組大鼠肝臟組織中SREBP-1c、FASN、ACC1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

本研究通過(guò)采取高脂飼料的培養(yǎng)方式來(lái)構(gòu)建肥胖模型，有較高的成功率，而部分大鼠沒(méi)有造模成功可能是因?yàn)榇嬖诜逝值挚棺饔?。肝臟組織作為脂質(zhì)代謝最主要的器官，食物中的脂肪會(huì)被運(yùn)送到肝臟進(jìn)行代謝，而長(zhǎng)期大量脂肪的攝入，使得肝臟中脂質(zhì)代謝處于長(zhǎng)期超負(fù)荷狀態(tài)，對(duì)肝組織造成損傷。本研究結(jié)果顯示，肥胖模型大鼠的體質(zhì)量及血清中ALT、AST水平明顯升高，表明肥胖引起了肝功能受損，而過(guò)表達(dá)SIK1后，體質(zhì)量及ALT、AST水平降低，表明SIK1可能具有緩解肝損傷的作用。同時(shí)對(duì)脂代謝主要指標(biāo)檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)SIK1后，大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平較肥胖大鼠降低，HDL-C水平較肥胖大鼠升高，表明SIK1能夠影響大鼠的脂代謝進(jìn)程；HE染色及油紅O染色也證實(shí)了過(guò)表達(dá)SIK1能夠改善肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、氣球樣變，并且橘紅色脂滴也明顯降低。切片觀(guān)察顯示有細(xì)胞數(shù)目減少的情況，因此推測(cè)肥胖大鼠肝損傷可能是肝細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的，對(duì)調(diào)控凋亡的關(guān)鍵蛋白Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平進(jìn)行分析，肥胖大鼠肝組織中Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平升高，而SIK1過(guò)表達(dá)后，Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平降低，表明SIK1可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡從而保護(hù)肝細(xì)胞。

TNF-α、IL-6是炎癥反應(yīng)中最早釋放的一類(lèi)促炎性細(xì)胞因子，能夠募集多種炎癥因子引起“瀑布式”炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起過(guò)度炎癥反應(yīng)從而損傷細(xì)胞。IL-10則是一類(lèi)主要的抗炎因子，能夠減慢胰島素信號(hào)的惡化，并抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，在維持炎癥因子平衡過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。iNOS作為一種存在于肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及白細(xì)胞中的誘導(dǎo)型NOS，正常情況下不表達(dá)，而TNF-α可以作為其刺激因子，誘導(dǎo)iNOS表達(dá)，催化L-精氨酸來(lái)生成細(xì)胞毒性作用的NO。本研究結(jié)果顯示，肥胖大鼠模型外周血中TNF-α、iNOS、IL-6、IL-10表達(dá)水平均顯著升高，其中IL-10水平的升高可能是機(jī)體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，來(lái)保護(hù)肝組織免受過(guò)度炎癥損傷，而SIK1過(guò)表達(dá)之后，TNF-α、iNOS、IL-6等促炎性細(xì)胞抑制因子水平降低，而抗炎癥細(xì)胞因子IL-10水平顯著升高，表明SIK1還能夠改善肝組織中的炎癥反應(yīng)從而減輕肝組織損傷。

SREBP-1c是SREBP的一種異構(gòu)體，其具有潛在的生脂作用，在肝臟、白色脂肪組織以及骨骼肌中高表達(dá)，并且SREBP-1c還能作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，直接激活脂質(zhì)代謝過(guò)程中的30多個(gè)基因的表達(dá)從而調(diào)控脂質(zhì)代謝，其中FASN和ACC1作為催化脂質(zhì)代謝的重要基因，在體外培養(yǎng)試驗(yàn)中證實(shí)，SREBP-1c能夠促進(jìn)FASN和ACC1表達(dá)，增加TG的合成及沉積。本研究結(jié)果顯示，肥胖模型大鼠肝組織中SREBP-1c、FASN、ACC1表達(dá)水平均明顯升高，而SIK1過(guò)表達(dá)后SREBP-1c、FASN、ACC1表達(dá)水平明顯降低，可能是因?yàn)镾IK1能夠直接調(diào)控SREBP-1c表達(dá)，過(guò)表達(dá)SIK1抑制了SREBP-1c表達(dá)，對(duì)下游生脂基因的激活效應(yīng)降低，生脂基因表達(dá)降低，脂質(zhì)合成代謝紊亂情況得到改善，從而減輕了肝組織的損傷。

綜上，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠肝組織明顯受損且有大量脂肪堆積，過(guò)表達(dá)SIK1后能夠降低生酯基因表達(dá)，改善脂代謝紊亂，減少脂肪堆積對(duì)肝組織的損傷。