CLIC4對胃癌細胞SGC-7901增殖與遷移的影響

李 瑤，馮 成，程曉敏，李 超，耿慧武，劉曉穎，王 華

中國是胃癌發(fā)病率和病死率較高的國家之一，亟需更有效的生物標志物或藥物靶標。CLIC4作為胞內(nèi)氯離子通道(chloride intracellular channel, CLICs)蛋白家族成員之一，在某些腫瘤類型和基質(zhì)細胞中異常高表達，且其定位和功能的改變，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究表明，子宮平滑肌瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和黑色素瘤等腫瘤形成過程中CLIC4的表達顯著上調(diào)；而人原發(fā)性肺癌和肺癌細胞系中CLIC4的表達減少，表明其抑制肺癌細胞生長；siRNA介導的CLIC4下調(diào)促進小鼠肝癌Hca-F和Hca-P細胞的凋亡。目前CLIC4對胃癌作用的研究鮮有報道，該研究從胃癌細胞系SGC-7901著手，研究CLIC4對細胞增殖與遷移的影響，為進一步探索CLIC4在胃癌惡性進展中的作用提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1

主要試劑 胎牛血清購于以色列Biological Industries公司；RPMI-1640和Opti-MEM培養(yǎng)基購于美國GE公司；胰酶細胞消化液、青霉素-鏈霉素混合液、Western細胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Western一抗稀釋液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine RNAi MAX試劑購于美國Thermo-Fisher公司；PVDF膜購于加拿大Bio Basic公司；β-actin、CLIC4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin抗體購于武漢Proteintech公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記兔抗山羊IgG、DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2

主要儀器 CO恒溫培養(yǎng)箱(VIOS 160i，美國 Thermo-Fischer公司)；BSC-2級生物安全柜(1300，美國Thermo-Fischer公司)；倒置光學顯微鏡(TS-100，日本株式會社尼康)；高速冷凍離心機(Microfuge 20R，美國Beckman Coulter公司)；恒壓電泳儀(PowerPacBasic，美國BIO-RAD公司)。

1.1.3

shRNA和siRNA CLIC4 shRNA、siRNA和陰性對照shRNA、siRNA合成于上海吉瑪生物科技有限公司，序列為見表1、2。

表1 shRNA序列

表2 siRNA序列

1.1.4

質(zhì)粒、細胞株 慢病毒包裝所用pLKO.1、REV、GAG、VSVG質(zhì)粒由中國科學技術(shù)大學吳緬教授課題組惠贈；HEK 293T、GES-1、 SGC-7901、BGC-823、MGC-803、MKN-45、N87、AEG-1細胞為本實驗室保存；其中GES-1，為正常腺上皮細胞，作為對照組，SGC-7901、BGC-823、MGC-803、MKN-45、N87、AEG-1均為胃癌細胞系。

1.2 實驗方法

1.2.1

細胞培養(yǎng)和傳代 HEK 293T細胞系使用DMEM高糖培養(yǎng)基；GES-1、SGC-7901、BGC-823、MGC-803、MKN-45、N87和AEG-1細胞系使用RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5 % CO、95 %濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)所用器具均經(jīng)高壓蒸汽滅菌；培養(yǎng)的細胞每1～2 d換液1次，顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，當細胞密度大于90 %時可進行傳代，使用胰酶對目的細胞進行消化，以培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)并計數(shù)，接種適量細胞懸液到培養(yǎng)瓶中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2

慢病毒包裝 以1.5×10個/孔的數(shù)量接種HEK 293T細胞于6孔板；次日觀察細胞貼壁生長至70%～80%后，使用Lipofectamine2000將混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中；轉(zhuǎn)染時質(zhì)粒所用的比例為pLKO.1(或含相應(yīng)shRNA的質(zhì)粒)：GAG∶REV∶VSVG(后3者在細胞內(nèi)共同形成慢病毒)=2∶2∶2∶1；在轉(zhuǎn)染6～8 h后更換新鮮的無抗生素培養(yǎng)基；在轉(zhuǎn)染30 h后收集培養(yǎng)液上清液中的病毒以進行后續(xù)實驗。

1.2.3

shRNA敲低實驗 感染前1 d，將SGC-7901細胞以2.0×10個/孔接種于6孔板，次日觀察貼壁后，加入上述包裝得到的病毒懸液和適當?shù)膒olybrene(終濃度：6～8 μg/ml)以感染SGC-7901；在6 h后換新鮮培養(yǎng)基；在48 h后使用嘌呤霉素篩選陽性細胞，并收集細胞進行驗證。

1.2.4

siRNA敲低實驗 轉(zhuǎn)染前1 d，將待轉(zhuǎn)染細胞以1.5×10個/孔的數(shù)量接種于6孔板；次日觀察貼壁后，使用Lipofectamine RNAi MAX轉(zhuǎn)染siRNA；轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)液。

1.2.5

細胞總蛋白提取 收集細胞沉淀，加入適當體積的細胞裂解液，冰上裂解30 min左右，每5 min渦旋1次；4 ℃，14 000 r/min離心25 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，Bradford法測蛋白濃度。

1.2.6

Western blot實驗 各取30 μg總蛋白樣品，于金屬浴上100 ℃加熱8～10 min變性，SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白于PVDF膜；5 %脫脂牛奶于室溫封閉1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min；一抗孵育4 ℃過夜，TBST洗膜3次；室溫孵育二抗1.5 h，TBST洗膜3次；ECL顯影。使用Image J軟件進行條帶的吸光度分析，并以β-actin為內(nèi)參計算CLIC4的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 CLIC4在胃癌細胞系中的表達

Western blot檢測胃癌細胞系中CLIC4的表達情況。結(jié)果顯示，與對照組(GES-1)相比，胃癌細胞系中CLIC4均高表達。對條帶的灰度值進行測定，以β-actin作為內(nèi)參，進行半定量分析，對3次重復實驗的結(jié)果進行匯總，同時以GES-1組的數(shù)據(jù)為基準，制作胃癌細胞系中CLIC4蛋白相對含量的直方圖(見圖1)。與對照組相比，胃癌細胞系中CLIC4高表達，且差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

圖1 Western blot檢測胃癌細胞系中CLIC4的表達

表3 各組中CLIC4的統(tǒng)計結(jié)果

2.2 CLIC4敲低對SGC-7901的細胞增殖的影響

為了進一步研究CLIC4在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的生物學作用，使用CLIC4 shRNA慢病毒感染胃癌細胞SGC-7901，并通過嘌呤霉素篩選及Western blot驗證目的蛋白的表達，構(gòu)建CLIC4敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，同時使用空白慢病毒載體pLKO.1(NC)做陰性對照。結(jié)果如圖2所示，與NC相比，各shRNA組的CLIC4表達量均降低，選擇1、2和3序列進行后續(xù)研究；經(jīng)三代驗證，SGC-7901穩(wěn)定低表達CLIC4的細胞株構(gòu)建成功(圖2)。為避免嘌呤霉素藥篩對細胞凋亡檢測的影響，同時使用CLIC4 siRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901，轉(zhuǎn)染72 h后收集細胞沉淀，進行Western blot驗證。結(jié)果顯示，與NC相比，CLIC4的兩條siRNA序列均有敲低效果。在確認了siRNA及shRNA對CLIC4的敲低效果后，利用克隆形成實驗以及CCK-8實驗檢測CLIC4敲低對胃癌細胞SGC-7901增殖的影響，結(jié)果見圖3?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果表明，與NC組相比，SGC-7901 細胞中CLIC4 sh1、2和3三條敲低序列的克隆數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，且CCK-8結(jié)果進一步驗證，CLIC4敲低對胃癌細胞的增殖沒有影響。

圖2 Western blot檢測SGC-7901細胞中CLIC4敲低效果

圖3 CLIC4敲低后SGC-7901細胞的增殖情況

2.3 CLIC4敲低對SGC-7901細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影響

為了探究CLIC4敲低對胃癌細胞遷移的影響，利用Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果顯示，與NC相比，在SGC-7901細胞CLIC4 shRNA的1和2序列組中，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達水平增加，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達無明顯變化，波形蛋白(Vimentin)表達減少(圖4)。該結(jié)果表明CLIC4敲低后，細胞上皮表型增強，間質(zhì)表型減弱，說明細胞發(fā)生了EMT，相應(yīng)的EMT過程受到抑制，結(jié)果見表4、5。

圖4 Western blot檢測SGC-7901細胞中CLIC4

表4 各組中N-cadherin的統(tǒng)計結(jié)果

表5 各組中vimentin的統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

CLICs家族成員具有不同功能，可參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、遷移及其對非腫瘤組織的侵襲。特別是CLIC4，可以靶向腫瘤細胞而不影響正常細胞的生理功能，具有成為腫瘤治療新靶點的潛能。

CLIC4在細胞中定位于細胞膜、線粒體內(nèi)膜，高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在特定組織中表達水平高，在一些腫瘤中過表達。細胞質(zhì)中的CLIC4響應(yīng)p53、DNA損傷和代謝應(yīng)激而入核，使細胞生長停滯或凋亡。CLIC4表達水平和核易位在細胞應(yīng)激/凋亡信號轉(zhuǎn)導中起重要作用。還有研究表明，腫瘤中的CLIC4的細胞定位可能發(fā)生改變。

有研究表明，CLIC4參與調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲。結(jié)直腸癌腫瘤干細胞中高表達CLIC4，特別是轉(zhuǎn)移能力強的腫瘤轉(zhuǎn)移干細胞(metastatic cancer stem cell, MCSC)與轉(zhuǎn)移能力弱的結(jié)腸癌細胞相比，CLIC4的表達水平更高，提示CLIC4參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌MCSC的分化及其侵襲、轉(zhuǎn)移行為。CLIC1和CLIC4沉默時，可以抑制默克爾細胞多瘤病毒小腫瘤抗原(MCPyVST)誘導的運動性和侵襲性，抑制默克爾細胞癌的進展。Suh et al利用CLIC4反義mRNA抑制CLIC4的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLIC4下調(diào)促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，在體外和體內(nèi)抑制人骨肉瘤細胞的生長。且CLIC4調(diào)節(jié)腫瘤間質(zhì)成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，并且與腫瘤的進展有關(guān)，提示CLIC4還通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究通過構(gòu)建CLIC4穩(wěn)定低表達胃癌細胞株，探究CLIC4在胃癌中的生物學功能。結(jié)果表明，CLIC4在胃癌細胞系中均高表達，不影響胃癌細胞SGC-7901的增殖。EMT是促進腫瘤侵襲、遷移的主要機制之一，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等是EMT的重要標志物，當E-cadherin的表達下降，N-cadherin和Vimentin表達增高時，腫瘤細胞骨架系統(tǒng)排列發(fā)生變化，細胞生物學性狀改變，黏附功能下降，脫離原發(fā)灶，向周圍組織侵襲和遷移。CLIC4敲低后E-cadherin的蛋白表達水平增加，Vimentin蛋白表達減少，從而抑制SGC-7901細胞的遷移，但具體分子機制仍需進一步探討。

但也有研究表明，不同細胞類型CLIC4對其增殖的作用及機制也不同，如小鼠和人皮膚鱗狀細胞癌中，過表達CLIC4抑制腫瘤生長并且促進TGF-β信號傳導。在肺癌細胞中，敲除CLIC4促進細胞增殖與克隆形成能力。且CLIC4可能對同一腫瘤類型的不同分化程度也具有不同的作用。Wang et al的研究結(jié)果顯示，在高分化胃癌細胞系NCI-N87中敲除CLIC4后，促進了EMT進而促進細胞遷移，細胞在裸鼠中成瘤能力增強；在低分化細胞系MKN-45中過表達CLIC4后，EMT被抑制，細胞干性表型減弱，細胞增殖被抑制。而本研究結(jié)果顯示，在中分化的胃癌細胞系SGC-7901中敲低CLIC4后，細胞增殖無顯著性變化，EMT被抑制，細胞遷移減弱。由此可以推測，在癌癥的不同進程階段，CLIC4可能發(fā)揮著不同的作用，也需要進一步的臨床樣本進行分析和驗證。

綜上所述，在胃癌細胞SGC-7901中，CLIC4通過促進胃癌細胞的遷移發(fā)揮促癌作用，但不影響其增殖。該研究為進一步探索CLIC4在胃癌惡性進展中的作用提供了重要線索，CLIC4可能作為臨床上治療胃癌的潛在靶點。