長(zhǎng)鏈非編碼RNA PCAT-1對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制研究

王繼軍，吳 凡，李瑤瑤，孔桂美，郁多男

胰腺癌是全球癌癥相關(guān)死亡率的第三大原因，且胰腺癌的發(fā)病率和病死率仍在逐年增加。雖然胰腺癌的治療手段隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步取得了較大的進(jìn)展，但是胰腺癌患者的預(yù)后仍然較差，其中位總生存期少于7個(gè)月，5年生存率僅為6%左右。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一種長(zhǎng)度超過(guò)200核苷酸的非編碼RNA，研究表明lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。lncRNA前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(prostate cancer-associated transcript 1, PCAT-1)最初在前列腺癌中被鑒定，lncRNA PCAT-1的異常表達(dá)在越來(lái)越多的惡性腫瘤中被報(bào)道，其過(guò)表達(dá)與細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、存活、細(xì)胞周期、腫瘤耐藥和同源重組等有關(guān)。Wang et al報(bào)道lncRNA PCAT-1在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，但是lncRNA PCAT-1在胰腺癌中其它的生物學(xué)功能未知。該文研究了lncRNA PCAT-1對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制，旨在獲得lncRNA PCAT-1作為胰腺癌治療潛在分子靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與材料

胰腺癌細(xì)胞系Capan-1、Capan-2、PANC-1、SW1990和正常胰腺細(xì)胞hTERT-HPNE(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))。細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗和胰酶(美國(guó)Gibco公司)；Bestar 1Strand cDNA合成試劑盒(上海DBI?Bioscience公司)；TRIzol 試劑和SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；PCAT-1 shRNA(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, MTS]試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)；蛋白裂解液(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Thermo公司)；PVDF(美國(guó)Bio-Rad)。細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)、周期素依賴性激酶6(cyclin-dependent kinase 6, CDK6)、 B細(xì)胞白血病/淋巴瘤2 (B-cell leukemia/lymphoma 2, Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)、磷酸化磷酸肌醇3-激酶(Phosphorylation phosphoinositide 3-kinases, pPI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B, pAKT)抗體(美國(guó)Proteintech公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和感染

細(xì)胞系Capan-1、Capan-2、PANC-1、SW1990和hTERT-HPNE快速?gòu)?fù)蘇后重懸于含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，放置在37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中。按照下述qRT-PCR方法檢測(cè)出高表達(dá)lncRNA PCAT-1的胰腺癌細(xì)胞，以1.0×10個(gè)/孔接種至6孔板中，分為對(duì)照組(sh-NC組)和實(shí)驗(yàn)組(sh-PCAT-1組)，NC shRNA和PCAT-1 shRNA經(jīng)病毒感染增強(qiáng)液感染至各組細(xì)胞中，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，病毒感染12 h后換液。sh-NC：5′-CCGCAGGTATGCACGCGT-3′；sh-PCAT-1： 5′-AUACAUAAGACCAUGGAAAU-3′。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA PCAT-1的表達(dá)

胰酶消化離心收集細(xì)胞，加入TRIzol試劑裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中總RNA。按照Bestar 1Strand cDNA試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒的說(shuō)明書配制qRT-PCR反應(yīng)體系，按照反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)各樣品的循環(huán)閾值(threshold cvcle, Ct)，按照2公式計(jì)算PCAT-1相對(duì)表達(dá)量。lncRNA PCAT-1引物，(F)5′-AATGGCATGAACCTGGGAGGCG-3′, (R)5′-GGCTTTGGGAAGTGCTTTGGAG-3′。內(nèi)參GAPDH引物，(F) 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, (R) 5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.4 MTS

PCAT-1細(xì)胞以每孔2 000個(gè)細(xì)胞鋪至96孔板中，分為對(duì)照組(sh-NC組)和實(shí)驗(yàn)組(sh-PCAT-1組)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，按上述1.2項(xiàng)中的感染方法進(jìn)行shRNA感染，分別在感染0、24、48、72、96 h時(shí)，每孔加入100 μl培養(yǎng)基、20 μl MTS試劑，并在培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣品在490 nm處的吸光度(optical density,OD)值，做生長(zhǎng)曲線。

1.5 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

胰酶消化收集6孔板中感染shRNA 72 h的各組細(xì)胞，加入1 ml預(yù)冷的無(wú)水乙醇4 ℃固定細(xì)胞2 h以上，PBS洗2次離心后按照周期試劑盒說(shuō)明書加入染色緩沖液及染色液，37 ℃避光孵育30 min進(jìn)行細(xì)胞染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞周期比例。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采用無(wú)EDTA的胰酶消化收集6孔板中感染shRNA 72 h的各組細(xì)胞，PBS洗2次離心后按照細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書加入染色緩沖液及染色液，室溫避光孵育15 min進(jìn)行細(xì)胞染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

1.7 皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)

將揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買的16 g左右的BALB/c雌性裸鼠隨機(jī)分為兩組，即sh-NC和sh-PCAT-1組，每組5只裸鼠，細(xì)胞用PBS洗2次后重懸至PBS中，濃度為1.5×10個(gè)/ml，以每只100 μl sh-NC和sh-PCAT-1細(xì)胞注射至各組裸鼠右側(cè)腋窩皮下，并且每周采用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤子長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，瘤子成長(zhǎng)體積為(a×b/2)，7周左右時(shí)處死裸鼠，稱重瘤子重量。所有的操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)

收集6孔板中感染shRNA 72 h的各組細(xì)胞，采用蛋白裂解液將細(xì)胞裂解后，高速離心獲得細(xì)胞總蛋白。檢測(cè)蛋白濃度后，以每個(gè)樣品50 μg的質(zhì)量上樣進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)，8% BSA室溫封閉1 h，一抗(1∶500) 4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶8 000)室溫孵育2 h，ECL超敏化學(xué)發(fā)光曝光，Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA PCAT-1在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示lncRNA PCAT-1在胰腺癌細(xì)胞Capan-1、Capan-2、PANC-1、SW1990中的表達(dá)高于在正常胰腺細(xì)胞hTERT-HPNE中的表達(dá)，在PANC-1細(xì)胞中的表達(dá)最高(

F

=145.36，

P

=0.000)，見(jiàn)圖1。

2.2 PCAT-1 shRNA感染效果

采用qRT-PCR驗(yàn)證PCAT-1 shRNA感染PANC-1細(xì)胞效果，sh-NC組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PCAT-1相對(duì)表達(dá)量為(1.00±0.00)，sh-PCAT-1組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PCAT-1相對(duì)表達(dá)量為(0.31±0.05)。sh-PCAT-1組中l(wèi)ncRNA PCAT-1相對(duì)表達(dá)量低于sh-NC組(

t

=13.24,

P

=0.003)。PCAT-1 shRNA可以干擾PANC-1細(xì)胞中PCAT-1的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA PCAT-1在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

圖2 qRT-PCR 驗(yàn)證PCAT-1 shRNA感染效果

2.3 MTS檢測(cè)沉默lncRNA PCAT-1的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

PCAT-1 shRNA感染胰腺癌細(xì)胞PANC-1 48 h后，MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh-PCAT-1組PCAT-1細(xì)胞增殖能力降低(48 h:

t

=2.39,

P

=0.038；72 h:

t

=4.19,

P

=0.012；96 h:

t

=10.84,

P

=0.000)，見(jiàn)圖3。

圖3 MTS檢測(cè)干擾lncRNA PCAT-1的表達(dá)對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的影響與sh-NC組比較：*P<0.05

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)沉默lncRNA PCAT-1的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞周期的影響

PCAT-1 shRNA感染胰腺癌細(xì)胞PANC-1 72 h后，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,與sh-NC組相比，sh-PCAT-1組PANC-1細(xì)胞阻滯在G0/G1期(

t

=3.98,

P

=0.030)，見(jiàn)圖4。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)沉默lncRNA PCAT-1的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響

PCAT-1 shRNA感染胰腺癌細(xì)胞PANC-1 72 h后，細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示,與sh-NC組相比，sh-PCAT-1組PANC-1細(xì)胞凋亡增加(

t

=6.59,

P

=0.027)，見(jiàn)圖5。

2.6 皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默lncRNA PCAT-1的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)能力的影響

PCAT-1 shRNA感染胰腺癌細(xì)胞PCAT-1 72 h后，皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh-PCAT-1組PANC-1細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力降低(6周:

t

=4.19,

P

=0.012；7周:

t

=11.35,

P

=0.000)，見(jiàn)圖6。

2.7 lncRNA PCAT-1對(duì)細(xì)胞周期蛋白及凋亡相關(guān)

蛋白的影響

收集感染72 h的各組蛋白，Western blot結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh-PCAT-1組細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白cyclinD1和CDK6蛋白的表達(dá)減少，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白減少，促凋亡蛋白Bax蛋白表達(dá)增加，見(jiàn)圖7。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾lncRNA PCAT-1的表達(dá)對(duì)PANC-1細(xì)胞周期的影響與sh-NC組比較：*P<0.05

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾lncRNA PCAT-1的表達(dá)對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡的影響與sh-NC組比較：*P<0.05

圖6 皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾lncRNA PCAT-1的表達(dá)對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的影響

2.8 lncRNA PCAT-1對(duì)細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

收集轉(zhuǎn)染72 h的各組蛋白，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，與sh-NC組相比，sh-PCAT-1組細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白pPI3K和pAKT蛋白的表達(dá)降低，見(jiàn)圖8。

圖7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾lncRNA PCAT-1的表達(dá)對(duì)PANC-1細(xì)胞中周期蛋白的影響與sh-NC組比較：*P<0.05

3 討論

lncRNA是目前研究較多的非編碼RNA之一，其可作為癌基因或抑癌基因參與包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝、遷移、侵襲、細(xì)胞周期停滯、凋亡和自噬等各種生物學(xué)過(guò)程，可作為抗腫瘤治療的藥物靶點(diǎn)。腫瘤相關(guān)lncRNA之一PCAT-1位于染色體8q24上，存在于Myc癌基因上游大約725 bp的位置處，該區(qū)域在腫瘤中處于擴(kuò)增狀態(tài)。研究報(bào)道lncRNA PCAT-1在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，干擾lncRNA PCAT-1的表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。同時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA PCAT-1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲低lncRNA PCAT-1的表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。在卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA PCAT-1表達(dá)增加，敲低lncRNA PCAT-1后細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力受到抑制。表明lncRNA PCAT-1與腫瘤的增殖、遷移、侵襲和凋亡等功能相關(guān)，Wang et al已經(jīng)證實(shí)干擾lncRNA PCAT-1的表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，但是lncRNA PCAT-1對(duì)胰腺癌增殖和凋亡的影響機(jī)制未見(jiàn)有報(bào)道，因此本文對(duì)此進(jìn)行了研究。首先采用qRT-PCR檢測(cè)lncRNA PCAT-1在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示lncRNA PCAT-1在4株胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)均高于在正常胰腺細(xì)胞hTERT-HPNE中的表達(dá)，與lncRNA PCAT-1在胰腺癌組織中表達(dá)水平的報(bào)道具有一致性。并采用慢病毒感染胰腺癌細(xì)胞抑制lncRNA PCAT-1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA PCAT-1的表達(dá)在體外抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡和細(xì)胞周期阻滯，在體內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖8 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾lncRNA PCAT-1的表達(dá)對(duì)PCAT-1細(xì)胞PI3K/AKT的影響與sh-NC組比較:*P<0.05

lncRNA PCAT-1通過(guò)抑制RNA結(jié)合基序5(RBM5)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。增殖和凋亡是腫瘤發(fā)生中的兩大重要的作用機(jī)制，其中細(xì)胞周期失控是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的重要原因，細(xì)胞周期是依賴于細(xì)胞周期蛋白(cyclins)和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)而受到嚴(yán)密的調(diào)控，可以通過(guò)作用于這些蛋白阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程，進(jìn)而抑制腫瘤的增殖。本文研究顯示沉默lncRNA PCAT-1可使胰腺癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，結(jié)直腸癌報(bào)道中干擾lncRNA PCAT-1的表達(dá)同樣阻滯細(xì)胞在G0/G1期，cyclinD1可與CDK4或者CDK6結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，cyclinD1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致G0/G1期過(guò)短，進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，本研究顯示抑制lncRNA PCAT-1的表達(dá)后，細(xì)胞中cyclinD1、CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)減少，表明lncRNA PCAT-1通過(guò)作用周期蛋白調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的增殖。此外，課題組檢測(cè)了lncRNA PCAT-1對(duì)抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表達(dá)的影響，結(jié)果顯示抑制lncRNA PCAT-1的表達(dá)后，Bcl-2蛋白的表達(dá)減少，Bax蛋白的表達(dá)增加，在結(jié)腸癌中也有相似的報(bào)道，結(jié)果顯示lncRNA PCAT-1通過(guò)作用于凋亡蛋白影響細(xì)胞的凋亡。PI3K/AKT信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的重要通路之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其下游信號(hào)分子包括cyclinD1及Bcl-2蛋白，且在胰腺癌中高表達(dá)，因此課題組檢測(cè)了沉默lncRNA PCAT-1細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的變化，結(jié)果顯示pPI3k和pAKT蛋白表達(dá)減少，表明lncRNA PCAT-1可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路作用于細(xì)胞周期和凋亡蛋白促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。

綜上，lncRNA PCAT-1在胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，沉默lncRNA PCAT-1的表達(dá)后細(xì)胞增殖能力降低和細(xì)胞凋亡增多，可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用。lncRNA PCAT-1可能是胰腺癌治療的新型分子靶點(diǎn)。