miR-21調(diào)控STAT3信號(hào)通路對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及遷移的影響

符策君，吳麗珍，陳澤婷，林 海，孫為增

腎母細(xì)胞瘤是一種臨床上常見的小兒惡性腫瘤，一般在1～3歲時(shí)期發(fā)病，幾率約為8%，首發(fā)癥狀主要為腹部出現(xiàn)腫塊，其發(fā)生對(duì)于病患的致殘率、病死率以及家庭的生活狀態(tài)均有一定的影響。腎母細(xì)胞瘤的治療主要以手術(shù)及放化療為主，對(duì)患兒的生存率有一定的積極影響，但仍有部分患兒療效、預(yù)后不佳，因此對(duì)其發(fā)生進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究至關(guān)重要。微小RNA(microRNA，miR)是一種具有高度保守性質(zhì)的非編碼小RNA，對(duì)機(jī)體的生理病理等方面具有不可或缺的參與調(diào)控作用，在癌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等過程中都有著舉足輕重的調(diào)控作用。該研究就miR-21在STAT3信號(hào)通路上對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)遷移的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1

細(xì)胞系 人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系購(gòu)自上海莼試生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)CS-011-0148。

1.1.2

主要試劑 miR-21模擬物及miR-NC購(gòu)自江蘇百奧邁科公司；hsa-mir-21、DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：1165-092)、胰蛋白酶(貨號(hào)：25200-072)、胎牛血清(貨號(hào)：10735078001)購(gòu)自上?；鈱?shí)業(yè)公司；Li-pofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號(hào)：11668-019)、TRIzol試劑盒(貨號(hào)：RG008)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Real-time PCR試劑盒(貨號(hào)：E090)購(gòu)自上海欣百諾生物公司；SDS-PAGE凝膠快速配置制試劑盒(貨號(hào)：SJH0899)購(gòu)自上海如吉生物公司。

1.1.3

主要儀器 Mx 3005P熒光定量PCR儀(美國(guó)Agilent公司)；凝膠成像系統(tǒng) BioSenSC300(上海山富科學(xué)儀器有限公司)；GL20A 全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(湖南儀器儀表廠離心機(jī)廠)；MV-Ⅲ型小型單垂直板電泳槽、OS-Ⅰ型回旋脫色搖床、MV-Ⅱ型垂直板電泳槽(大連競(jìng)邁科技生物有限公司)；Y-ZCP3000 型電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備公司)。

1.2 病例資料

腎母細(xì)胞瘤組織和癌旁組織標(biāo)本選自2015年1月—2019年12月海南省人民醫(yī)院收治且經(jīng)病理組織學(xué)確診為腎母細(xì)胞瘤患兒32例，男女比例為20/12，年齡0～8(3.54±1.90)歲，同時(shí)選取癌旁組織(距癌≥3 cm)作為對(duì)照。該研究通過了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合道德倫理要求，且得到患兒監(jiān)護(hù)人同意并簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1

細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培育人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系G401細(xì)胞株，置于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度82%左右，用胰蛋白酶進(jìn)行1 min的消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)1～2 d更換1次培養(yǎng)基，選取保存生長(zhǎng)良好的細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞分為空白組、si-miR-21組及si-miR-21 NC組。si-miR-21組轉(zhuǎn)染miR-21模擬物，si-miR-21 NC組轉(zhuǎn)染miR-NC，空白組不做干預(yù)。操作步驟如下：將人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞按60%的密度進(jìn)行接種混勻，第2天細(xì)胞融合度至40%的時(shí)候進(jìn)行轉(zhuǎn)染，2次PBS洗滌后每孔均加入DMEM培養(yǎng)基(2 ml，含20%胎牛血清)，用去離子水溶解siRNA至20 μmol/L，將siRNA與500 μl無(wú)血清DMEM相溶，混勻、靜置，即A管，Li-pofectamine2000與無(wú)血清DMEM混勻靜置，即B管，AB管混勻靜置20 min后加入各孔中，培養(yǎng)4～6 h，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)2 d。RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3

RT-PCR檢測(cè)miR-21表達(dá) 利用裂解液裂解轉(zhuǎn)染細(xì)胞及腎母細(xì)胞瘤組織和癌旁組織，TRIzol法提取總RNA，定量后通過一步法對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，按照RT-PCR試劑盒說明書完成miR-21表達(dá)的檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參，通過2公式分析得到miR-21相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4

Western blot檢測(cè)STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，Western blot檢測(cè)STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。操作步驟如下：提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白后，按照BCA試劑盒說明書定量分析，SDS-PAGE電泳得到沉淀蛋白， 保存于-80 ℃下。準(zhǔn)備工作完成后，加入TBST液稀釋的一抗(1∶200)，PVDF轉(zhuǎn)膜2 h后培養(yǎng)于4 ℃的條件下12 h，完成后清洗，同樣加入稀釋的二抗(1∶1 000)，轉(zhuǎn)膜，室溫下進(jìn)行2 h的培育，洗脫二抗后顯影，以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)比灰度值后得出相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5

MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將si-miR-21組、si-miR-21 NC組和空白組細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μl，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞貼壁后收集檢測(cè)，分別在0、24、48、72 h等時(shí)間段進(jìn)行收集，然后將CCK-8(10∶1)加入其中，培育4 h后使用酶標(biāo)儀對(duì)A值進(jìn)行檢測(cè)，A值越高表示細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)。

1.3.6

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 應(yīng)用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞后，加入PBS洗滌液洗滌，收集細(xì)胞后加入Binding Buffer(500 μl)、Annexin V-FITC(5 μl)混勻，室溫下避光培養(yǎng)5 min，最后使用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.3.7

Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 將培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞懸液配制后在Transwell小室的上層中接種，風(fēng)干后將結(jié)晶紫(500 μl，0.1%)加入染色，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)發(fā)生遷移狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 miR-21的表達(dá)

miR-21在腎母細(xì)胞瘤組織中相對(duì)表達(dá)量為6.12±1.03，在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量1.09±0.26，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=26.663，

P

<0.05)。

2.2 STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1)，p- STAT3、Bcl-2及Bcl-xl在空白組、si-miR-21組和si-miR-21 NC組的相對(duì)表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=52.335、20.952、58.471；

P

<0.001)。與空白組比較，si-miR-21組轉(zhuǎn)染細(xì)胞p- STAT3、Bcl-2及Bcl-xl相對(duì)表達(dá)量升高(

P

<0.05)，si-miR-21 NC組表達(dá)下降(

P

<0.05)。與si-miR-21組比較，si-miR-21 NC組轉(zhuǎn)染細(xì)胞p- STAT3、Bcl-2及Bcl-xl相對(duì)表達(dá)量降低(

P

<0.05)。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-21表達(dá)與p- STAT3、Bcl-2及Bcl-xl表達(dá)水平相關(guān)性分析

由以上結(jié)果可知，干擾miR-21表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞p- STAT3、Bcl-2及Bcl-xl相對(duì)表達(dá)量受到影響，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞 miR-21與p- STAT3、Bcl-2及Bcl-xl進(jìn)行Pearson檢驗(yàn)分析顯示，miR-21與p- STAT3、Bcl-2及Bcl-xl呈正相關(guān)，見表1。

表1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-21與與p- STAT3、Bcl-2

2.4 miR-21對(duì)人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，A吸光度值隨隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大，72 h 3組A吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=11.990，

P

<0.001)，與空白組比較，si-miR-21組轉(zhuǎn)染細(xì)胞A吸光度值升高(

P

<0.05)，si-miR-21 NC組下降(

P

<0.05)，見圖2。

圖1 Western blot檢測(cè)STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白

2.5 miR-21對(duì)人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞凋亡率空白組、si-miR-21 NC組和si-miR-21組3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=57.413；

P

<0.001)，與空白組比較，si-miR-21組轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞凋亡率下降(

P

<0.05)，si-miR-21 NC組升高(

P

<0.05)，見圖3。

圖2 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖情況

2.6 miR-21對(duì)人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞遷移數(shù)空白組、si-miR-21 NC組和si-miR-21組3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=81.580，

P

<0.001)，與空白組比較，si-miR-21組細(xì)胞遷移數(shù)升高(

P

<0.05)，si-miR-21 NC組下降(

P

<0.05)，見圖4。

3 討論

腎母細(xì)胞瘤是小兒腹部常見的一種惡性實(shí)體腫瘤，腎母細(xì)胞瘤多為一側(cè)發(fā)病，少數(shù)雙側(cè)發(fā)病，患兒早期或出現(xiàn)腹痛惡心、食欲不振等癥狀，或表現(xiàn)出高血壓、發(fā)熱等癥狀，晚期時(shí)消瘦、咯血等。目前多采用手術(shù)聯(lián)合放化療的方式進(jìn)行治療，但較多病例早期出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的狀況，出現(xiàn)預(yù)后不良的情況，因而對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，從而提高預(yù)后效果就尤為重要。

圖3 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況

圖4 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移情況 結(jié)晶紫染色×400

作為一種非編碼小RNA，miR可通過結(jié)合靶基因3’-UTR區(qū)，對(duì)目的基因的表達(dá)施行調(diào)控作用。大量研究表明miRNA與細(xì)胞的生命活動(dòng)以及腫瘤的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)。miR-21最早在脊椎以及非脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)，如胃癌、乳腺癌、卵巢癌等，可能與其發(fā)生進(jìn)展有關(guān)。印滇 等在了解肝細(xì)胞癌以及miR-21的基礎(chǔ)上對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，通過細(xì)胞侵襲、細(xì)胞活力的檢測(cè)以及靶基因關(guān)系分析后顯示，miR-21在肝癌細(xì)胞中呈高表達(dá)的狀態(tài)，PDCD4呈低表達(dá)的狀態(tài)，最終得出miR-21可通過干擾PDCD4 影響HCC細(xì)胞的生命活動(dòng)。何少儀 等對(duì)宮頸癌患者中miR-21的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。由此可知miR-21的高表達(dá)對(duì)患者具有消極影響，對(duì)于腫瘤的負(fù)荷情況具有反映作用。該研究結(jié)果顯示，相比于癌旁組織，腎母細(xì)胞瘤的miR-21表達(dá)水平明顯升高，提示miR-21呈高表達(dá)是影響腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的潛在危險(xiǎn)因素。STAT3信號(hào)通路與大多數(shù)的炎性反應(yīng)過程相關(guān)，也有證據(jù)表明STAT3是一種致癌基因，細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因具有活化的作用，與細(xì)胞的增殖、存活等有關(guān)。

為了探討miR-21對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖及遷移產(chǎn)生影響的相關(guān)機(jī)制，本研究選用人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系G401細(xì)胞來(lái)進(jìn)行研究，將其分為空白組、si-miR-21組以及si-miR-21 NC組，通過轉(zhuǎn)染miR-21類似物和抑制物干擾腫瘤細(xì)胞miR-21表達(dá)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明si-miR-21組轉(zhuǎn)染細(xì)胞p-STAT3、Bcl-2及Bcl-xl相對(duì)表達(dá)量明顯比空白組升高，而si-miR-21 NC組比空白組下降，結(jié)果表明干擾miR-21表達(dá)后轉(zhuǎn)染細(xì)胞p-STAT3、Bcl-2及Bcl-xl蛋白表達(dá)水平明顯發(fā)生變化，雙變量相關(guān)分析顯示miR-21與p-STAT3、Bcl-2及Bcl-xl蛋白呈正相關(guān)。p-STAT3是表示STAT3信號(hào)通路活化的重要指標(biāo)，結(jié)果表明了miR-21過表達(dá)可加劇STAT3信號(hào)通路的活化。Bcl-2和Bcl-xl蛋白作為細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，其表達(dá)水平升高可抑制細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡率顯示同樣的結(jié)果，說明miR-21過表達(dá)會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。此外，MTS實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示A490吸光度值隨隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大，72 h時(shí)si-miR-21組轉(zhuǎn)染細(xì)胞A490吸光度值高于空白組，si-miR-21 NC組低于空白組；細(xì)胞遷移數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)與A490吸光度值一致，提示過表達(dá)miR-21可促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖和遷移作用。

綜上，miR-21對(duì)于腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖以及遷移具有促進(jìn)作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)STAT3信號(hào)通路的表達(dá)引起。