煙酰胺對鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖、凋亡與遷移作用機制研究

楊亞利，張聲源，潘增烽，陳歡珠，姚前尹

鼻咽癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移性，主要分布在中國華南地區(qū)、東南亞和北非等區(qū)域。由于早期鼻咽癌患者癥狀的非特異性，臨床上預(yù)測鼻咽癌發(fā)展的準(zhǔn)確性不高。故研究鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找用于鼻咽癌早期診斷及預(yù)后評估的分子標(biāo)志物和安全有效的治療藥物有重要的臨床意義。煙酰胺，又稱維生素PP，具有加強DNA修復(fù)并參與能量代謝及腫瘤預(yù)防與治療的作用?？诜髣┝繜燉０房稍鰪姳茄拾┑姆暖煰熜?，但其是否通過影響鼻咽癌細(xì)胞生長來增強療效的分子機制需進一步確認(rèn)。該研究以人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1為研究對象，探討煙酰胺對人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖、凋亡、周期和遷移能力的影響及其相關(guān)作用機制，旨在為其臨床應(yīng)用提供更多理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要試劑

人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細(xì)胞庫。煙酰胺，純度>99%，貨號：YZ-1001 15-100 mg，品牌：中檢所。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)；青-鏈霉素(北京索萊寶公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京全式金生物公司)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物公司)；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板(貨號：353097)和matrigel膠(貨號：356234)(美國Becton,Dickinson and Company公司)；p53和MMP-9單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2 主要儀器

IX70倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Tecan Infinite 200全自動酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；流式細(xì)胞儀(美國Becton,Dickinson and Company公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜電泳槽( 美國BIO-RAD公司)。

1.3 人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液。待細(xì)胞長成致密單層后，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期的人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10個/ml，加入96孔板中，每孔100 μl。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，分為對照組和煙酰胺處理組，煙酰胺處理組加入煙酰胺至終濃度為10、20、40、80 μmol/L，對照組則加入等體積不含藥物的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h和72 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μl，培養(yǎng)2 h后，450 nm測定各孔的吸光度(optical density，OD)值，計算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡

收集對照組細(xì)胞和40 μmol/L 煙酰胺處理48 h后的CNE-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后用預(yù)冷的PBS洗滌3次，于295 μl細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min，再加入碘化丙啶(PI)5 μl，4 ℃避光反應(yīng)5 min，用流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率，并計算處于G/G期、S期和G/M期的細(xì)胞所占比例。

1.6 Transwell法檢測細(xì)胞的遷移和侵襲

收集對照組和40 μmol/L煙酰胺處理48 h后的CNE-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后加入Transwell小室。下室加入600 μl完全培養(yǎng)基。上室加入相應(yīng)體積無血清的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)48 h。取出小室，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗1次，顯微鏡下觀察。每個樣本隨機取5個視野計數(shù)透膜細(xì)胞并拍照，每個視野細(xì)胞計數(shù)3次，求出平均值。

1.7 qRT-PCR檢測CNE-1細(xì)胞p53和MMP-9 mRNA水平

收集對照組和40 μmol/L煙酰胺處理48 h后的CNE-1細(xì)胞，提取細(xì)胞總mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行qRT-PCR檢測。引物序列有，MMP-9(F): 5′-GACGCCATCGCGGAGATTG-3′；MMP-9(R): 5′-GCCACTTGTCGGCGATAAG-3′；p53(F): 5′-CAAGACAGAAGGGCCTGACTC-3′；p53(R): 5′-CATCTCCCAAACATCCCTCAC-3′；Hsa-Actinβ(F): 5′-GGCACCCAGCACAATGAAG-3′；Hsa-Actinβ(R): 5′-GGTGTAACGCAACTAAGTCATAG-3′。

1.8 Western blot檢測CNE-1細(xì)胞p53和MMP-9相關(guān)蛋白表達(dá)

收集對照組和40 μmol/L煙酰胺處理48 h后的CNE-1細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并進行蛋白定量檢測，聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜，室溫孵育一抗p53、MMP-9、β-actin(1∶1 000)，加相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，最后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)顯影，凝膠分析軟件處理計算各組 p53、MMP-9蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 煙酰胺對人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖的影響

人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度(10、20、40、80 μmol/L)煙酰胺處理作用48、72 h后，CNE-1細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制，表現(xiàn)為隨著OD值逐漸降低，增殖抑制率逐漸升高，各組CNE-1細(xì)胞增殖抑制率隨著煙酰胺濃度的升高和處理時間的延長而升高，呈濃度和時間依賴。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0. 01)，見圖1。

圖1 煙酰胺對鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 煙酰胺對人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1細(xì)胞凋亡和周期的影響

40 μmol/L煙酰胺處理CNE-1細(xì)胞48 h總凋亡率高于對照組(表1，圖2A)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=2.78，

P

<0.01)；與對照組相比，40 μmol/L煙酰胺處理組G/G期細(xì)胞比例降低(

t

=4.30，

P

<0.01)，S期細(xì)胞比例無明顯變化，G/M期細(xì)胞比例升高(

t

=2.78，

P

<0.05)(圖2B)，表明煙酰胺能夠?qū)NE-1細(xì)胞阻滯于G/M期。

2.3 煙酰胺對人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響

用40 μmol/L煙酰胺處理CNE-1細(xì)胞48 h后，與對照組相比，40 μmol/L煙酰胺處理組發(fā)生遷移的透膜細(xì)胞數(shù)減少(

t

=2.45，

P

<0.01)(圖3A)；同時，相比于對照組，40 μmol/L煙酰胺處理組發(fā)生侵襲的透膜細(xì)胞數(shù)減少(

t

=2.45，

P

<0.01)(圖3B)。

表1 煙酰胺對鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡和周期的影響

2.4 煙酰胺對人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中野生型p53和MMP-9表達(dá)的影響

與對照組相比，40 μmol/L煙酰胺處理組p53 mRNA相對表達(dá)量，p53基因表達(dá)量升高(

t

=2.30，

P

<0. 01)，同時p53蛋白表達(dá)量升高(圖4A、C)；與對照組相比，40 μmol/L煙酰胺處理組基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9 mRNA相對表達(dá)量，MMP-9基因表達(dá)降低(

t

=2.78，

P

<0.01)，同時MMP-9蛋白表達(dá)量降低(圖4B、D)。

圖2 煙酰胺對人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡和周期的影響

圖3 煙酰胺對人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響×100

圖4 煙酰胺對人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞p53蛋白和蛋白酶MMP-9表達(dá)的影響

3 討論

鼻咽癌是一種低分化、高轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤，其發(fā)病與細(xì)胞周期失調(diào)密切相關(guān)。為了進一步了解鼻咽癌發(fā)生的分子機制，研究人員利用基因編輯技術(shù)，對鼻咽癌細(xì)胞進行全基因組CRISPR基因敲除篩選，鑒定并確認(rèn)與NPC相關(guān)的細(xì)胞因子和信號通路，如MYST組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶復(fù)合體、NF-κB信號通路及p53信號途徑等。p53是細(xì)胞中最為重要的腫瘤抑制因子之一，它能夠響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外眾多的信號刺激，通過引起細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進DNA損傷修復(fù)等過程抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其在鼻咽癌及頭頸部鱗癌、非小細(xì)胞癌、肺癌、膀胱癌等治療中也有極其重要的地位。

該研究結(jié)果表明，人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞經(jīng)過煙酰胺處理后細(xì)胞增殖受到明顯抑制，與濃度及時間具有一定相關(guān)性，且細(xì)胞凋亡增加。這與槲皮素通過非依賴性Caspase誘導(dǎo)NPC細(xì)胞凋亡的機制不同，本研究中腫瘤抑制基因p53的表達(dá)量顯著升高，表明煙酰胺可能通過調(diào)節(jié)p53的表達(dá)去激活或抑制p53相關(guān)信號通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，并引發(fā)細(xì)胞周期阻滯。p53在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)可加劇癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移速率誘導(dǎo)，研究表明突變的p53可以通過Wnt信號通路參與調(diào)控中性粒細(xì)胞促進乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在癌細(xì)胞遷移研究中，MMP-9在腫瘤侵襲、腫瘤誘導(dǎo)的血管生成、腫瘤微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)以及介導(dǎo)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成以促進腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等細(xì)胞擴散過程中發(fā)揮不同作用。同時已有研究顯示MMP-1參與鼻咽癌細(xì)胞的侵襲過程。該研究中，煙酰胺可以明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力，同時鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降低。這與野生型p53表達(dá)上升，細(xì)胞凋亡進程恢復(fù)的結(jié)果一致，但煙酰胺抑制鼻咽癌的具體機制有待進一步研究。

綜上，煙酰胺可通過上升p53蛋白的表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞周期抑制人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖，促進其凋亡，同時亦可影響MMP-9蛋白的表達(dá)降低CNE-1細(xì)胞遷移和侵襲能力。