miR101調(diào)控EZH2抑制胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞葡萄糖吸收參與妊娠糖尿病機(jī)制研究

王圓圓，王明勝，趙玉潔，石中華

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指孕婦在妊娠期間發(fā)生或發(fā)現(xiàn)糖耐量減低，是產(chǎn)科常見的并發(fā)癥。研究顯示GDM給母嬰帶來極大的危害，高血糖可使胚胎發(fā)育異常或死亡，并且流產(chǎn)發(fā)生率極高，GDM孕婦妊娠期高血壓疾病和后期糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)比非糖尿病孕婦高。目前GDM主要以降糖藥物治療為主，雖然具有一定療效但安全性仍有很大的爭(zhēng)議。近年來，多數(shù)學(xué)者熱衷于從分子機(jī)制探討GDM發(fā)病機(jī)制，如研究發(fā)現(xiàn)miR-29、miR-200a和miR-126等小分子物質(zhì)在GDM患者與非GDM中表達(dá)水平存在差異，抑制miR-29b表達(dá)可上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子3A基因表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。微小RNA(microRNA)具有調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄水平功能的微小RNA，通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)而作用于生物體內(nèi)細(xì)胞，從而使目的基因mRNA翻譯受到抑制或mRNA降解。miR101家族是高度保守的microRNA，可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，研究顯示miR101過表達(dá)可下調(diào)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶同源序列2增強(qiáng)子(Enhancer of histone methyltransferase homologue 2 ，EZH2)和MYC基因表達(dá)從而能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。EZH2可抑制染色質(zhì)中的靶基因，與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能障礙可能與妊娠期高血壓、GDM、胎兒生長(zhǎng)受限、流產(chǎn)等妊娠并發(fā)癥密切相關(guān)，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)葡萄吸收與妊娠糖尿病具有一定關(guān)聯(lián)。本研究旨在觀察miRNA101影響EZH2表達(dá)水平及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞葡萄糖吸收情況，探討miRNA101在妊娠期糖尿病中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2018年1月—2018年5月在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的GDM孕婦30例和正常孕婦30例分別作為觀察組和對(duì)照組，孕婦在妊娠24～28周進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，符合以下1項(xiàng)或以上的診斷標(biāo)準(zhǔn)即可診斷為GDM：空腹≥5.1 mmol/ L；1 h血糖≥10.0 mmol/L；2 h血糖≥8.5 mmol/ L。觀察組和對(duì)照組在年齡、胎次等資料上具有可比性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組孕婦均為單胎，既往均無高血壓、糖尿病、腎病及心血管疾病病史。所有患者均需簽訂知情同意書，并表示愿意積極配合研究工作，本次研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，符合倫理要求。

1.2 方法

1.2.1

樣本收集 在孕婦分娩后立即剪取胎盤母體面小葉處組織，分為4份并用PBS洗滌液洗凈，置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?0%甲醛固定。

1.2.2

qRT-PCR檢測(cè)胎盤組織miR101和EZH2 mRNA表達(dá) 嚴(yán)格按照各試劑盒和儀器說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，利用qRT-PCR檢測(cè)胎盤組織中miR101和EZH2 mRNA表達(dá)水平。

1.2.3

Western blot檢測(cè)胎盤組織中EZH2蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞加入裂解緩沖液30 min，用離心機(jī)離心10 min，4 ℃、12 000 r/min，提取各組細(xì)胞的總蛋白。按照說明書方法，利用Western blot檢測(cè)胎盤組織中EZH2蛋白表達(dá)水平。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1

細(xì)胞培養(yǎng) 取人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、雙抗青霉素/鏈霉素液、高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.2

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取miR101 mimics、miR101 mimics NC系列、miR101 inhibitor及miR101 inhibitor NC系列對(duì)上述培養(yǎng)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將培養(yǎng)細(xì)胞置于按3×10個(gè)/孔接種于6孔板中，嚴(yán)格按照Lipofectamine2000說明書操作，加入1.5 μl miR101 mimics(M組)、miR101 mimics NC(M-NC組)、miR101 inhibitor(I組)及miR101 inhibitor NC(I-NC組)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(B組)，48 h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3

qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR101和EZH2 mRNA表達(dá) 嚴(yán)格按照各試劑盒和儀器說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，利用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR101和EZH2 mRNA表達(dá)水平。

1.3.4

Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞EZH2蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞的總蛋白，按照說明書方法，利用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞EZH2蛋白表達(dá)水平。

1.3.5

轉(zhuǎn)染細(xì)胞葡萄糖消耗量檢測(cè) 取各組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，取各組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，用葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收量，計(jì)算各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞葡萄糖消耗量(葡萄糖消耗量=培養(yǎng)基葡萄糖含量-24 h后所測(cè)葡萄糖含量)。

2 結(jié)果

2.1 胎盤組織miR101表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，觀察組胎盤組織miR101表達(dá)水平高于對(duì)照組(

t

=5.433,

P

<0.05)(圖1)。

圖1 2組miR101表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.2 胎盤組織EZH2表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，觀察組胎盤組織EZH2mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組(

t

=2.352,

P

<0.05)(圖2A)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，觀察組胎盤組織EZH2 蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(

t

=2.178,

P

<0.05)(圖2B、圖3)。

圖2 2組EZH2表達(dá)表達(dá)水平比較

圖3 Western blot檢測(cè)胎盤組織EZH2蛋白表達(dá)

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR101表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖4)，miR101表達(dá)水平在B組、M-NC組和M組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=27.302，

P

<0.05)，M組高于B組(

t

=2.133，

P

<0.05)，M組高于M-NC組(

t

=2.167，

P

<0.05)。miR101表達(dá)水平在B組、I-NC組和I組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=16.499，

P

<0.05)，I組低于B組(

t

=2.918，

P

<0.05)，I組低于I-NC組(

t

=2.331，

P

<0.05)。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后EZH2表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖5A、B)，EZH2 mRNA表達(dá)水平在B組、M-NC組和M組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=15.381，

P

<0.05)，B組高于M組(

t

=3.266，

P

<0.05)，M-NC組高于M組(

t

=3.190,

P

<0.05)；EZH2 mRNA表達(dá)水平在B組、I-NC組和I組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=9.463，

P

<0.05)，B組低于I組(

t

=2.276，

P

<0.05)，I-NC組低于I組(

t

=2.176,

P

<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖5C、D，圖6)，EZH2蛋白表達(dá)水平在B組、M-NC組和M組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=17.593，

P

<0.05)，B組高于M組(

t

=2.018，

P

<0.05)，M-NC組高于M組(

t

=2.257,

P

<0.05)；EZH2蛋白表達(dá)水平在B組、M-NC組和M組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=21.748，

P

<0.05)，B組低于I組(

t

=3.271，

P

<0.05)，I-NC組低于I組(

t

=3.167，

P

<0.05)。

圖4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR101表達(dá)水平

圖5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后EZH2表達(dá)水平

圖6 Western blot檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞EZH2蛋白表達(dá)

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后葡萄糖吸收情況

B組(1.26±0.20) mmol/L、M-NC組(1.22±0.12) mmol/L和M組(1.75±0.21) mmol/L葡萄糖消耗量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=12.523，

P

<0.05)，M組高于B組和M-NC組(

t

=3.106、2.115，均

P

<0.05)。B組、I-NC組(1.13±0.27) mmol/L和I組(0.68±0.09) mmol/L葡萄糖消耗量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=31.161，

P

<0.05)I組低于B組和I-NC組(

t

=2.002、2.158，

P

<0.05)。

3 討論

GDM的病因極為復(fù)雜，迄今為止仍未得以完全闡明。研究表明遺傳基因、炎癥因子、脂肪細(xì)胞因子和胰島素抵抗是其主要病因，尤其是胰島素抵抗患者在GDM的發(fā)病中有著重大作用。胰島素抵抗的產(chǎn)生主要原因是靶組織對(duì)胰島素的敏感性降低，持續(xù)性的胰島素抵抗會(huì)造成胰島β細(xì)胞的胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足，進(jìn)而引起糖尿病的發(fā)生。

miRNAs是調(diào)控靶向基因的小分子非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、分化和代謝中扮演了重要的角色，多項(xiàng)研究表明miRNAs參與多種疾病病理機(jī)制。目前，在miRNAs與GDM關(guān)聯(lián)研究中，多數(shù)學(xué)者的觀點(diǎn)都支持GDM發(fā)病與miRNAs調(diào)控靶向基因相關(guān)，盡管發(fā)病相關(guān)機(jī)制不是很明確，但通過體外實(shí)驗(yàn)和模擬實(shí)驗(yàn)可證實(shí)它們存在一定聯(lián)系。miR101作為microRNA的一種，學(xué)者對(duì)其研究比較深入，以往研究中miR101被認(rèn)為是促癌基因，miR101過表達(dá)會(huì)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞的增殖。安麗 等在總結(jié)miR101與糖脂代謝關(guān)聯(lián)研究中，提到miR101與2型糖尿病和GDM發(fā)生息息相關(guān)。EZH2是由組蛋白、賴氨酸、N-甲基轉(zhuǎn)移酶組成的核心蛋白復(fù)合體，與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有關(guān)。有多項(xiàng)研究證實(shí)，miR101可通過調(diào)控EZH2表達(dá)參與調(diào)控多種疾病的進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，GDM患者胎盤組織miR101表達(dá)水平更高，而EZH2表達(dá)水平下降，提示miR101過表達(dá)可能是GDM發(fā)病的潛在風(fēng)險(xiǎn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GDM與miR101的相關(guān)性，開展了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，給人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR101 mimics和miR101 inhibitor試劑，通過上調(diào)和抑制miR101的表達(dá)觀察EZH2表達(dá)和細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收量的影響。結(jié)果表明過表達(dá)的miR101能抑制EZH2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞吸收葡萄糖，抑制miR101表達(dá)呈現(xiàn)出相反的結(jié)果。因此推測(cè)，過表達(dá)的miR101可下調(diào)EZH2表達(dá)，EZH2表達(dá)水平下降使胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，從而導(dǎo)致葡萄糖吸收受到影響。

綜上，miR101可能通過調(diào)控EZH2表達(dá)降低胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收量，參與GDM病理機(jī)制。該研究仍有不足之處，研究人群樣本量相對(duì)較少，不具有群體代表性，有些微小效應(yīng)仍未觀察到，進(jìn)一步了解該分子機(jī)制仍需要構(gòu)建動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證。