腎動(dòng)脈去交感神經(jīng)術(shù)對(duì)大鼠急性心肌梗死后室性心律失常的影響及相關(guān)機(jī)制的研究

肖蓉雪，郜俊清，汪 谞，劉宗軍,

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI) 大多是在冠脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠狀動(dòng)脈急性或持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，可并發(fā)心律失常、休克或心力衰竭，嚴(yán)重可危及生命。其中在A(yíng)MI后發(fā)生的持續(xù)性室性快速性心律失常引起的心臟猝死占心血管死亡率的50%以上。既往研究表明心肌梗死后，心律失常的發(fā)生與交感神經(jīng)興奮過(guò)度及心肌細(xì)胞電生理特性改變密切相關(guān)。腎動(dòng)脈去交感神經(jīng)消融術(shù)(renal denervation，RDN)是近年來(lái)一種通過(guò)降低交感神經(jīng)活性，抑制腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(renin angiotensin aldosterone system，RASS)激活治療難治性高血壓的新興微創(chuàng)介入技術(shù)。已有研究證實(shí)RDN可減少心臟交感神經(jīng)活動(dòng)，并有效抑制房顫的發(fā)生，縮短房顫的持續(xù)時(shí)間。因此，RDN有望通過(guò)降低交感神經(jīng)活性，抑制電重構(gòu)等途徑抑制心律失常的發(fā)生。該研究旨在探討RDN對(duì)AMI后室性心律失常的影響，并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只清潔型SD雄性大鼠，體重230 g左右，均購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)，所有的實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)上海市醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將24只SD大鼠隨機(jī)分成4組：Control組、AMI組、RDN-1d+AMI組、RDN-2w+AMI組，每組6只，建立模型作相應(yīng)處理。

1.2 RDN手術(shù)模型建立

用2.5%的戊巴比妥鈉溶液對(duì)SD大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后大鼠平躺，固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮，用75%的酒精棉球消毒，于腹部中線(xiàn)做一個(gè)手術(shù)切口，用鹽水浸過(guò)的無(wú)菌紗布覆蓋腸子，分離雙側(cè)腎動(dòng)脈，然后用溶于95%乙醇的10%苯酚溶液的無(wú)菌紗條輕輕纏繞雙側(cè)腎血管1周，盡量避免苯酚與周?chē)K器組織接觸，1 min后取出紗布。術(shù)畢，逐層縫合切口，青霉素連續(xù)注射3 d預(yù)防感染，按照分組情況進(jìn)行飼養(yǎng)；1 d和2周后進(jìn)行心梗造模，處死大鼠后取腎動(dòng)脈進(jìn)行病理檢測(cè)，各組大鼠沒(méi)有炎癥滲出，感染不嚴(yán)重。

1.3 AMI模型的建立

對(duì)不同分組的SD大鼠用2.5%的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠用橡皮筋固定在手術(shù)臺(tái)上，氣管插管成功后連接呼吸機(jī)。給大鼠接上電極，采用上海然哲PowerLab多導(dǎo)生理記錄儀采集信號(hào)，打開(kāi)心電圖采集軟件，設(shè)置好測(cè)量參數(shù)，然后在胸骨左側(cè)第3肋間處開(kāi)胸，顯露左冠狀動(dòng)脈前降支，于其中遠(yuǎn)段1/3交點(diǎn)處進(jìn)行結(jié)扎，心電監(jiān)護(hù)提示ST段持續(xù)弓背樣抬高，提示心梗造模成功，連續(xù)記錄1 h后處死，并留取大鼠心臟組織。

1.4 組織病理學(xué)檢測(cè)

取出的心臟組織標(biāo)本，清洗后，一部分用4%的多聚甲醛溶液固定，包埋在石蠟中，用于酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)染色，剩余樣本于-80 ℃下保存。

1.5 Western blot

提取心肌組織蛋白，通過(guò)Western blot檢測(cè)心肌梗死區(qū)各種離子通道Nav1.5、Cav1.2和Kir2.1的蛋白表達(dá)水平。

1.6 腎臟交感神經(jīng)活性(renal sympathetic never activity，RSNA)檢測(cè)

用2.5%的戊巴比妥鈉溶液對(duì) SD大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠右側(cè)臥位，備皮，剪開(kāi)背部皮膚，剪開(kāi)皮下筋膜組織，用濕棉簽鈍性分離，暴露出左側(cè)腎血管和腹主動(dòng)脈，在解剖顯微鏡下找到左側(cè)腎動(dòng)脈和腎神經(jīng)，分離腎交感神經(jīng)，將游離好的腎交感神經(jīng)輕放于雙極銀絲記錄電極上，經(jīng)前置放大器將記錄到的放電信號(hào)放大1 000倍后，通過(guò)美國(guó)Tektronix oscilloscope示波器和澳大利亞Pty.Ltd.Castle Hill生物信息采樣系統(tǒng)Power Lab/8SP儀器記錄信號(hào)，并分析。

2 結(jié)果

2.1 RDN對(duì)大鼠AMI后室性心律失常發(fā)生的影響

通過(guò)PowerLab多導(dǎo)生理記錄儀記錄模型建立的過(guò)程，并觀(guān)察1 h，結(jié)果顯示，與AMI組(331.2±74.8)次/h相比，RDN-1d+AMI組[(112±59.2)次/h，

F

=0.615，

P

<0.001]和RDN-2w+AMI組[(151±87.9)次/h，

F

=0.260，

P

=0.003]室性心動(dòng)過(guò)速(ventricular tachycardia，VT)發(fā)生次數(shù)減少，其中RDN-1d組較RDN-2w組減少次數(shù)更明顯。其中AMI組有1只大鼠發(fā)生室顫死亡，其他兩組大鼠沒(méi)有因室顫死亡。

2.2 腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)檢測(cè)

通過(guò)Power Lab/ 8SP儀器檢測(cè)記錄腎交感神經(jīng)放電信號(hào)，與Control組比較，RDN-1d組腎交感神經(jīng)放電減少(

F

=6.989，

P

<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Control組比較，RDN-2w組腎交感神經(jīng)放電也減少(

F

=20.216，

P

=0.033)，其中RDN-1d組放電減少更明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 RDN對(duì)腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)的影響

2.3 RDN對(duì)大鼠AMI后心臟神經(jīng)活性的影響

酪氨酸氫化酶是兒茶酚胺合成的關(guān)鍵酶，分布在腎上腺素能軸突的胞質(zhì)中，陽(yáng)性表達(dá)可代表心臟局部交感神經(jīng)的活性。通過(guò)TH染色法檢測(cè)心臟局部交感神經(jīng)活性，結(jié)果顯示，AMI組TH陽(yáng)性表達(dá)水平高，RDN-1d組和RDN-2w組TH陽(yáng)性表達(dá)水平低。見(jiàn)圖2。

2.4 Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌梗死區(qū)各離子通道蛋白水平的表達(dá)結(jié)果

通過(guò)Western blot檢測(cè)離子通道蛋白Nav1.5、Cav1.2和Kir2.1蛋白表達(dá)水平，與Control組Nav1.5、Cav1.2和Kir2.1水平對(duì)比，AMI組Nav1.5(

F

=6.086，

P

=0.030)、Cav1.2(

F

=3.769，

P

=0.011)和Kir2.1(

F

=0.324，

P

=0.007)水平下調(diào)；與AMI組比較，RDN-1d組Nav1.5(

F

=3.933，

P

=0.136)、Cav1.2(

F

=0.144，

P

=0.296)和Kir2.1(

F

=2.067，

P

=0.133)水平有上調(diào)趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與AMI組比較，RDN-2w組Nav1.5(

F

=1.397，

P

=0.004)、Cav1.2(

F

=6.464，

P

=0.027)和Kir2.1(

F

=1.093，

P

=0.005)水平上調(diào)，表明RDN能抑制Nav1.5、Cav1.2和Kir2.1蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，并與RDN治療時(shí)間有密切關(guān)系。見(jiàn)圖3。

圖2 RDN對(duì)大鼠AMI后心臟神經(jīng)活性的影響 TH染色 ×200

3 討論

AMI患者大多數(shù)并發(fā)不同程度的心律失常，其中持續(xù)性室性心律失常是最常見(jiàn)的并發(fā)癥，盡管目前有多種方法可以降低心肌梗死后室性心律失常的發(fā)生，但室性心律失常引起的心臟猝死仍占心血管病死亡率的50%以上。腎動(dòng)脈去交感神經(jīng)術(shù)是近年來(lái)可以通過(guò)降低交感神經(jīng)活性，抑制RASS系統(tǒng)激活治療難治性高血壓的一種微創(chuàng)介入技術(shù)。目前有研究顯示RDN能減少心肌梗死后室性心律失常的發(fā)生，但相關(guān)作用機(jī)制仍不明確。在本研究中，在大鼠發(fā)生AMI前進(jìn)行了RDN術(shù)，研究表明RDN組室性心動(dòng)過(guò)速的發(fā)生次數(shù)明顯減少，其中RDN術(shù)后1 d組效果更顯著，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中AMI組有1只大鼠發(fā)生室顫死亡，其他2組大鼠沒(méi)有因室顫死亡，說(shuō)明RDN能夠抑制急性心梗后室性心律失常的發(fā)生，從而降低死亡率。

有研究顯示心肌梗死區(qū)心肌交感神經(jīng)支配不均衡，兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)的分布出現(xiàn)不均衡，引起跨室壁復(fù)極離散度增加，最終引起室性心律失常發(fā)生。該研究中，通過(guò)腎交感神經(jīng)活性檢測(cè)和心臟TH染色法檢測(cè)交感神經(jīng)活性，結(jié)果顯示，與正常組比較，RDN組腎交感神經(jīng)放電都減少，其中RDN-1d組放電減少更明顯。與AMI組比較，RDN組TH陽(yáng)性表達(dá)都有減少，而TH在很多研究中被用來(lái)標(biāo)記心臟神經(jīng)纖維分布，該研究中，心肌梗死1 h后心臟交感神經(jīng)纖維尚未形成，但TH陽(yáng)性表達(dá)增加說(shuō)明AMI組心臟局部交感神經(jīng)活性增強(qiáng)，而RDN組心臟局部交感神經(jīng)活性減弱。綜上可得，RDN通過(guò)阻斷腎交感傳入神經(jīng)，抑制中樞反饋機(jī)制，從而抑制TH表達(dá)，降低心臟局部交感神經(jīng)活性，最終減少室性心律失常的發(fā)生，其中RDN術(shù)后早期抑制效果較后期可能更明顯。

AMI后心律失常的發(fā)生與靜息膜電位的去極化、動(dòng)作電位的延長(zhǎng)以及內(nèi)向整流鉀離子(IK1/Kir2.1)通道減少有關(guān)，其中Ca和Na通道參與動(dòng)作電位的形成。Yamada et al在探討RDN對(duì)心衰大鼠發(fā)生房顫的機(jī)制中發(fā)現(xiàn)4組大鼠CaV1.2、NaV1.5、Kir2.1 SERCA2和NCX離子通道蛋白表達(dá)相似，沒(méi)有差異性。隨后在心衰缺血模型兔中發(fā)現(xiàn)RDN可以通過(guò)抑制Cav1.2、Nav1.5、Kir2.1和KvLQT1的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，抑制心肌梗死后心衰家兔模型的電重構(gòu)并縮短有效不應(yīng)期和動(dòng)作電位時(shí)程。本研究結(jié)果提示RDN術(shù)后2w能夠抑制Nav1.5、Cav1.2和Kir2.1蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，而術(shù)后1d蛋白表達(dá)沒(méi)有下調(diào)，說(shuō)明RDN術(shù)后后期能夠通過(guò)抑制離子通道蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)電重構(gòu)，縮短有效不應(yīng)期和動(dòng)作電位時(shí)程，從而抑制心梗后室性心律失常的發(fā)生。

圖3 RDN對(duì)大鼠心肌梗死區(qū)各離子通道蛋白表達(dá)水平的影響

綜上，RDN能夠有效地降低AMI后室性心動(dòng)過(guò)速的發(fā)生，該機(jī)制可能與腎臟交感神經(jīng)放電活動(dòng)減少及離子通道蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)，其中RDN術(shù)后1 d腎臟交感神經(jīng)放電活動(dòng)減少，蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)變化不明顯，而RDN術(shù)后2w腎臟交感神經(jīng)放電活動(dòng)和蛋白表達(dá)水平調(diào)節(jié)都有改變，說(shuō)明RDN早期主要通過(guò)抑制腎臟交感傳入神經(jīng)這一途徑起作用，后期通過(guò)交感神經(jīng)興奮和離子通道蛋白兩個(gè)途徑同時(shí)起到抑制作用，最終抑制AMI后室性心律失常的發(fā)生。