Lnczc3h7a對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響及其機(jī)制

任鵬濤，郝英豪，阮紅訓(xùn)，秦曉寧，張 苑，黃 煒

結(jié)直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率較高，患者5年生存率較低。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展受多種基因及蛋白的調(diào)控，研究相關(guān)分子的生物學(xué)作用對(duì)解析結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制意義重大。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可對(duì)多種疾病的生理、病理過程產(chǎn)生影響。Lnczc3h7a是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA家族成員，其參與某些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但作用機(jī)制目前還鮮有報(bào)道。膠原三股螺旋重復(fù)蛋白6(collagen triple helix repeat protein 6，CTHRC6)是一種分泌性糖蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞遷移和減少膠原沉積的功能。研究顯示CTHRC6在結(jié)直腸癌、食管癌等實(shí)體瘤中異常表達(dá)，可能與腫瘤的侵襲、遷移有關(guān)。該研究擬分析Lnczc3h7a在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

6種結(jié)直腸癌細(xì)胞株(SW620、SW480、HCT116、DLD-1、Caco-2、HT-29)及正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系(FHC)均購(gòu)自北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；鼠抗人CTHRC6抗體及GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Lnczc3h7a模擬物(Lnczc3h7a mimics)和Lnczc3h7a抑制物(Lnczc3h7a inhibitor)購(gòu)自廣州銳博生物有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；熒光定量PCR儀7500購(gòu)自美國(guó)ABI公司；酶標(biāo)儀PerkinElmer購(gòu)自美國(guó)Enspire公司。

1.2 方法

1.2.1

RT-PCR法檢測(cè)Lnczc3h7a在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá) 按照RNA提取試劑盒說明書的操作步驟，提取6種結(jié)直腸癌細(xì)胞株和正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中的總RNA。按照RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。按照熒光定量試劑盒說明書，使用ABI 7500 PCR儀進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。采用2方法計(jì)算Lnczc3h7a的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.2

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞分別接種于3個(gè)T75培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%時(shí)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將Lnczc3h7a mimics和Lnczc3h7a inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別作為L(zhǎng)nczc3h7a mimics組和Lnczc3h7a inhibitor組，將未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3

CCK-8法檢測(cè)Lnczc3h7a對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響 將如上Lnczc3h7a mimics組、Lnczc3h7a inhibitor組、對(duì)照組收集的細(xì)胞以5×10/L密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入CCK-8溶液和含10%新生牛血清的1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于1、2、3、4、5 d時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lnczc3h7a對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響 將如上Lnczc3h7a mimics組、Lnczc3h7a inhibitor組、對(duì)照組收集的細(xì)胞以2×10個(gè)/L密度接種于6孔板中，置于CO培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)到90%以上，使用無菌槍頭在細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行劃痕，經(jīng)無菌PBS洗滌后，加入含0.5%新生牛血清的1640完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別采集0、24、48 h時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞遷移圖像，并計(jì)算遷移率。

1.2.5

Western blot檢測(cè)CTHRC6蛋白的表達(dá) 收集3組細(xì)胞，經(jīng)裂解后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取各組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，使用脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入按照CTHRC6抗體(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜；次日，經(jīng)TBS-T洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)，室溫?fù)u床孵育2 h，經(jīng)TBS-T洗滌3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物試劑檢測(cè)目的蛋白，曝光X線膠片，并利用Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 Lnczc3h7a在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示6種結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620、SW480、HCT116、DLD-1、Caco-2、HT-29中Lnczc3h7a的相對(duì)表達(dá)水平均低于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，見圖1。3組的Lnczc3h7a的相對(duì)表達(dá)水平比較見圖2。

2.2 Lnczc3h7a對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染1～3 d后，3組之間細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；轉(zhuǎn)染4～5 d后，Lnczc3h7a mimics組細(xì)胞增殖能力低于Lnczc3h7a inhibitor組和對(duì)照組(

P

<0.05)，Lnczc3h7a inhibitor組細(xì)胞增殖能力高于對(duì)照組(

P

<0.05)，見圖3。

圖1 Lnczc3h7a在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況與FHC細(xì)胞比較：*P<0.05

圖2 3組的Lnczc3h7a表達(dá)水平比較

2.3 Lnczc3h7a對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24、48 h后，對(duì)照組的傷口愈合率分別為(72.10±6.12)%、(59.73±8.32)%，Lnczc3h7a mimics組的傷口愈合率分別為(82.29±5.03)%、(72.81±6.27)%，Lnczc3h7a inhibitor組的傷口愈合率分別為(59.42±5.73)%、(38.69±7.64)%，3組比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=395.524、480.165,

P

<0.05)；與對(duì)照組相比，Lnczc3h7a mimics組細(xì)胞遷移能力降低(

P

<0.05)，Lnczc3h7a inhibitor組細(xì)胞遷移能力升高(

P

<0.05)，見圖4。

圖3 Lnczc3h7a對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 Lnczc3h7a對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中CTHRC6蛋白表達(dá)的影響

生物信息學(xué)分析顯示，Lnczc3h7a與CTHRC6蛋白具有相似的結(jié)合位點(diǎn)，二者可能存在內(nèi)在調(diào)控關(guān)聯(lián)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證Lnczc3h7a對(duì)CTHRC6蛋白表達(dá)的影響，該研究檢測(cè)了Lnczc3h7a mimics組、Lnczc3h7a inhibitor組、對(duì)照組中CTHRC6蛋白的表達(dá)情況，Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Lnczc3h7a inhibitor組中CTHRC6蛋白表達(dá)升高(

P

<0.05)，Lnczc3h7a mimics組中降低(

P

<0.05)，見表1、圖5。

3 討論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均呈增高趨勢(shì)。目前所知，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜生物學(xué)過程。探究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中所涉及的關(guān)鍵分子的生物學(xué)作用，對(duì)于結(jié)直腸癌的臨床治療具有重要意義。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)Lnczc3h7a對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響

表1 3組各腫瘤細(xì)胞株中的CTHRC6蛋白表達(dá)水平

圖5 Western blot法檢測(cè)Lnczc3h7a對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中CTHRC6蛋白表達(dá)的影響1：對(duì)照組；2：Lnczc3h7a inhibitor組；3：Lnczc3h7a mimics組

lncRNA是一類長(zhǎng)約220個(gè)核苷酸的非編碼長(zhǎng)鏈RNA，其可在表觀遺傳學(xué)、基因組轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面上調(diào)控基因的表達(dá)。Lnczc3h7a是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的lncRNA，其在頭頸部腫瘤、結(jié)直腸癌、胃癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎癌等多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)存在很大的差異性。最近有研究表明，Lnczc3h7a在某些高侵襲能力的腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)。另有研究顯示Lnczc3h7a與結(jié)直腸癌患者病情的惡性程度有關(guān)，但其在結(jié)直腸癌中的作用尚不清楚。本研究首先分析了Lnczc3h7a在結(jié)腸直癌細(xì)胞株和正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中表達(dá)的差異性，結(jié)果顯示6種結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620、SW480、HCT116、DLD-1、Caco-2、HT-29中Lnczc3h7a的相對(duì)表達(dá)水平均低于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞株FHC(

P

<0.05)，這一結(jié)果表明Lnczc3h7a可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。由于Lnczc3h7a在SW620細(xì)胞中表達(dá)最低，因此本研究中選取SW620細(xì)胞株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。為了進(jìn)一步研究Lnczc3h7a在結(jié)直腸癌中的作用，本研究通過向SW620細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Lnczc3h7a mimics和Lnczc3h7a inhibitor，實(shí)現(xiàn)調(diào)控Lnczc3h7a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Lnczc3h7a mimics組細(xì)胞增殖能力和遷移能力降低(

P

<0.05)，Lnczc3h7a inhibitor組細(xì)胞增殖能力和遷移能力升高(

P

<0.05)，表明Lnczc3h7a可能是通過抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移而發(fā)揮抑癌基因的作用。該研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了Lnczc3h7a的靶基因，結(jié)果顯示Lnczc3h7a與CTHRC6具有相似的結(jié)合位點(diǎn)，二者可能存在內(nèi)在調(diào)控關(guān)聯(lián)。CTHRC6蛋白是一種分泌性糖蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞遷移和減少膠原沉積的功能。最近有研究表明，CTHRC6在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，靶向沉默CTHRC6表達(dá)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力。為了驗(yàn)證Lnczc3h7a對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中CTHRC6蛋白表達(dá)的影響，該研究檢測(cè)了Lnczc3h7a mimics組、Lnczc3h7a inhibitor組、對(duì)照組中CTHRC6蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Lnczc3h7a inhibitor組中CTHRC6蛋白表達(dá)升高(

P

<0.05)，Lnczc3h7a mimics組中CTHRC6蛋白表達(dá)降低(

P

<0.05)，這一結(jié)果表明，Lnczc3h7a對(duì)結(jié)直腸癌CTHRC6蛋白表達(dá)具有抑制作用。因此推測(cè)Lnczc3h7a可能是通過靶向作用于CTHRC6抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

Lnczc3h7a在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，Lnczc3h7a過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，Lnczc3h7a可能通過靶向作用于CTHRC6而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移。