抗凝血酶Ⅲ活性檢測(cè)在HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭中的意義

王愛華，管世鶴，楊 凱，王 琴，周強(qiáng)，陳禮文，張 浩，孫蓓蓓

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)是我國(guó)最常見的肝衰竭類型。慢性HBV感染是我國(guó)ACLF主要病因，HBV感染相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者短中期病死率高達(dá)50%～90%，而HBV-ACLF的早期診斷和準(zhǔn)確預(yù)后評(píng)估尤為關(guān)鍵，目前，除終末期肝病模型(model for end-stage liver disease, MELD)評(píng)分外，有關(guān)ACLF的預(yù)后分析多基于臨床生化指標(biāo)的綜合分析，國(guó)外學(xué)者研究表明，凝血功能障礙與ACLF患者的出血和臨床轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，提示凝血相關(guān)指標(biāo)可能具有評(píng)估ACLF患者臨床預(yù)后潛在價(jià)值。抗凝血酶原Ⅲ(Antithrombin III，AT-Ⅲ)是人體最重要的生理性抗凝物質(zhì)，據(jù)報(bào)道，肝衰竭患者的肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞受損，能夠?qū)е聶C(jī)體AT-Ⅲ合成顯著減少。此外，Kuroda et al研究表明AT-Ⅲ在評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后具有重要臨床價(jià)值。為開展AT-Ⅲ與HBV-ACLF病情進(jìn)展及預(yù)后的相關(guān)性研究，選取臨床明確診斷的HBV-ACLF病人為研究對(duì)象，分析AT-Ⅲ活性水平與肝功能、凝血功能指標(biāo)及MELD評(píng)分的關(guān)系，并進(jìn)一步運(yùn)用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評(píng)價(jià)AT-Ⅲ能否作為預(yù)測(cè)HBV-ACLF臨床預(yù)后的影響因素，以探討其在HBV-ACLF中的檢測(cè)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1

病例資料 選取安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院病人中確診為HBV-ACLF的80例患者為研究對(duì)象，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《肝功能衰竭診療指南》(2018年版)，排除肝硬化、其它病毒感染、免疫相關(guān)性疾病和免疫調(diào)節(jié)劑使用者導(dǎo)致的肝功能衰竭，其中男性71例，女性8例，年齡25～78(48.52±12.37)歲，根據(jù)出院狀態(tài)將HBV-ACLF患者的臨床轉(zhuǎn)歸分為4組：好轉(zhuǎn)組(35例)、未好轉(zhuǎn)組(病情惡化放棄治療和內(nèi)科治療無效者共33例)、轉(zhuǎn)外院治療組(行肝移植者5例)和死亡組(7例)，其中以好轉(zhuǎn)組與未好轉(zhuǎn)組作為評(píng)判HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的分組。收集同期CHB患者48例作為對(duì)照組，符合《慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》(2019年版)，其中男性39例，女性9例，年齡19～63(46.35±11.47)歲。HBV-ACLF組和CHB對(duì)照組在性別和年齡等人口學(xué)特征方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 HBV-ACLF組與CHB組臨床檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果

1.1.2

試劑和儀器

STA

Evolution

型自動(dòng)血凝分析儀購(gòu)自上海穗豐醫(yī)療設(shè)備有限公司；貝克曼

AU

-5800全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自合肥德賽方圓生物技術(shù)有限公司，所有試劑均為原裝配套試劑。

1.2 方法

1.2.1

肝功能和凝血指標(biāo)的檢測(cè) 分別于入院時(shí)(納入預(yù)后分組的HBV-ACLF患者的抽血時(shí)間依次為入院第1、7、14、21、28天)采集HBV-ACLF和CHB患者的外周血各兩管，一管為普通生化管(無抗凝劑)4ml，另一管為特殊抗凝管(枸櫞酸鈉抗凝)2 ml，3 500 r/min，離心10 min,分別取血清和血漿，血漿標(biāo)本用于STA Evolution型自動(dòng)血凝分析儀檢測(cè)AT-Ⅲ、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time, APTT)，其中，PT國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio of prothrombin time，PT-INR)=(患者PT檢測(cè)值/PT正常對(duì)照值)，ISI為國(guó)際敏感指數(shù)；凝血酶原活動(dòng)度(PTA)=[PT正常對(duì)照-(PT正常對(duì)照×0.6)]÷[PT患者-(PT正常對(duì)照×0.6)]×100%。血清標(biāo)本用于貝克曼AU-5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽紅素(total bilirubin, TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、白蛋白(albumin, ALB)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(gamma glutamyltransferase, GGT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、肌酐(creatinine, CREA)。

1.2.2

MELD評(píng)分的計(jì)算 MELD評(píng)分計(jì)算公式：R=9.6×ln(CREA mg/dl)+3.8×ln(TBIL mg/dl)+11.2×ln(INR)+6.4×病因(病因：膽汁淤積性和酒精性肝硬化為0，病毒等其他原因肝硬化為1)。

2 結(jié)果

2.1 HBV-ACLF患者各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的變化

與CHB組相比，HBV-ACLF組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。其中TBIL、ALT、AST、GGT、ALP值升高，ALB水平下降，APTT延長(zhǎng)，PT-INR升高，PTA和AT-Ⅲ下降(表1)。

2.2 HBV-ACLF患者AT-Ⅲ活性水平與其他相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示，AT-Ⅲ活性水平高低與TBIL、PTA、PT-INR均具有相關(guān)性。其中AT-Ⅲ與TBIL呈負(fù)相關(guān)(ρ=-0.371，

P

=0.001)(圖1)；AT-Ⅲ與PT-INR呈負(fù)相關(guān)(ρ=-0.434，

P

<0.001)(圖2)；AT-Ⅲ與PTA呈正相關(guān)(ρ=0.550，

P

<0.001)(圖3)。

圖1 AT-Ⅲ與TBIL相關(guān)性分析

圖2 AT-Ⅲ與PT-INR相關(guān)性分析

圖3 AT-Ⅲ與PTA相關(guān)性分析

2.3 AT-Ⅲ在HBV-ACLF患者各臨床分組的表達(dá)水平

AT-Ⅲ在好轉(zhuǎn)組的表達(dá)水平為(25.53±13.03)%；未好轉(zhuǎn)組的表達(dá)水平為(18.47±9.45)%；轉(zhuǎn)外院治療組的表達(dá)水平為(9.08±4.57)%；死亡組的表達(dá)水平為(23.07±8.58)%，其中未好轉(zhuǎn)組與好轉(zhuǎn)組相比，AT-Ⅲ活性水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.02)。通過回顧性分析患者開始入院第1、7、14、21、28天 AT-Ⅲ的活性水平，結(jié)果顯示在好轉(zhuǎn)組隨著積極有效的治療，AT-Ⅲ活性水平逐步提升，未好轉(zhuǎn)組AT-Ⅲ活性逐漸下降，見圖4。

2.4 AT-Ⅲ與MELD評(píng)分在HBV-ACLF患者臨床預(yù)后分組的相關(guān)性分析

HBV-ACLF患者好轉(zhuǎn)組與未好轉(zhuǎn)組MELD評(píng)分分別為(26.38±3.81)、(30.47±5.95)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；Spearman相關(guān)性分析顯示，AT-Ⅲ與MELD評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(ρ= -0.368，

P

=0.002)，見圖5。

2.5 AT-Ⅲ聯(lián)合MELD評(píng)分預(yù)測(cè)HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的敏感性及特異性分析

ROC曲線結(jié)果顯示，采用AT-Ⅲ預(yù)測(cè)HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的曲線下面積為0.686(95%

CI

=0.558～0.813)，利用Youden指數(shù)確定Cutoff值為16.4%時(shí)，其敏感度為75.0%，特異度為52.9%，見圖6；采用MELD評(píng)分預(yù)測(cè)HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的曲線下面積為0.698(95%

CI

=0.573～0.823)，Cutoff值為28.5時(shí)，其敏感度為76.5%，特異度為55.9%；AT-Ⅲ聯(lián)合MELD評(píng)分預(yù)測(cè)HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的曲線下面積為0.756(95%

CI

=0.638～0.873)，Cutoff值分別為：AT-Ⅲ 20.1%，MELD評(píng)分25分，其敏感度為62.5%，特異度為88.2%，見圖7。

圖4 HBV-ACLF患者好轉(zhuǎn)組與未好轉(zhuǎn)組

圖5 AT-Ⅲ與MELD評(píng)分的相關(guān)性分析

圖6 AT-Ⅲ判斷HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的ROC曲線

圖7 AT-Ⅲ聯(lián)合MELD評(píng)分判斷HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的ROC曲線

3 討論

HBV-ACLF是一種伴有多器官功能障礙的慢性肝病嚴(yán)重惡化的綜合征，短期死亡率在28 d時(shí)可達(dá)30%～50%，在90 d時(shí)達(dá)到50%～80%。除肝臟移植外，HBV-ACLF患者在晚期暫無有效的策略，然而，部分HBV-ACLF患者的早期在接受適當(dāng)?shù)闹委熀缶哂锌赡嫘?。因此HBV-ACLF患者需及時(shí)被診斷，盡早對(duì)病情發(fā)展進(jìn)行有效評(píng)估，對(duì)短期生存預(yù)后進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，以指導(dǎo)臨床進(jìn)行治療策略調(diào)整，從而降低短期死亡率。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)對(duì)于HBV-ACLF的早期發(fā)現(xiàn)及療效評(píng)估尤為重要，AT-Ⅲ是肝細(xì)胞產(chǎn)生的重要抗凝物質(zhì)之一，研究表明AT-Ⅲ是肝細(xì)胞癌術(shù)后發(fā)生肝衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是評(píng)估肝功能儲(chǔ)備的重要參數(shù)，同時(shí)也是最強(qiáng)的單一預(yù)測(cè)急性肝功能衰竭的指標(biāo)，Di Giammarco et al研究表明AT-Ⅲ在預(yù)測(cè)心臟機(jī)械灌注病人的肝功能衰竭中具有較高的敏感性和特異性，然而AT-Ⅲ與HBV-ACLF病情的相關(guān)性，目前的報(bào)道有限。

該研究表明，與CHB對(duì)照組相比，HBV-ACLF患者組TBIL、ALT、AST、 ALP、GGT、PT-INR、APTT的表達(dá)水平增加，ALB、PTA、AT-Ⅲ表達(dá)水平減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。主要因?yàn)锳CLF患者肝臟細(xì)胞大量破壞，導(dǎo)致肝功能指標(biāo)明顯異常；肝臟是合成大部分凝血因子和抗凝因子的物質(zhì)，肝臟的損傷可以導(dǎo)致體內(nèi)凝血與纖溶系統(tǒng)失調(diào)，引發(fā)出血，因此肝衰竭患者存在明顯的凝血功能障礙。AT-Ⅲ活性水平在HBV-ACLF患者中降低，一方面因?yàn)锳CLF患者肝臟及內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損導(dǎo)致AT-Ⅲ合成量顯著減少；另一方面，肝臟合成的AT-Ⅲ不足以抑制凝血酶原及其因子的合成與表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體凝血酶原及其因子水平升高，反向抑制了其他組織細(xì)胞合成AT-Ⅲ，從而進(jìn)一步加重了AT-Ⅲ的缺乏。該研究分析了HBV-ACLF患者中AT-Ⅲ活性水平與其他臨床檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性，表明AT-Ⅲ活性水平與PTA正相關(guān)，與TBIL、PT-INR均呈負(fù)相關(guān)。而TBIL、PTA及PT-INR是鑒定ACLF的重要檢測(cè)指標(biāo)，某種程度上說明AT-Ⅲ活性水平可反映肝損傷的嚴(yán)重程度，與ACLF病情密切相關(guān)。在臨床分組研究中，AT-Ⅲ的表達(dá)在好轉(zhuǎn)組與未好轉(zhuǎn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中未好轉(zhuǎn)組AT-Ⅲ較好轉(zhuǎn)組降低；通過回顧性分析HBV-ACLF患者入院不同時(shí)間點(diǎn)的AT-Ⅲ活性水平，研究顯示，隨著住院時(shí)間的延長(zhǎng)，好轉(zhuǎn)組AT-Ⅲ活性水平逐步增加，未好轉(zhuǎn)組AT-Ⅲ活性水平逐漸降低。以上研究結(jié)果表明，AT-Ⅲ活性水平可能是評(píng)價(jià)HBV-ACLF患者預(yù)后的影響因素之一，AT-Ⅲ活性水平越低，預(yù)示ACLF患者的病情越嚴(yán)重，預(yù)后越差，若經(jīng)過積極有效的治療，AT-Ⅲ活性逐漸回升，提示病情有所好轉(zhuǎn)，這與國(guó)內(nèi)學(xué)者施海東 等的研究結(jié)果較一致，這可能是因?yàn)锳T-Ⅲ與肝細(xì)胞再生密切相關(guān)。AT-Ⅲ通過與肝素結(jié)合加速對(duì)凝血酶原復(fù)合物的滅活，減少血栓的形成，穩(wěn)定肝臟微循環(huán)；亦可減少白細(xì)胞黏附及血管的通透性，減輕炎癥反應(yīng)；同時(shí)還可通過誘導(dǎo)IGF-1的表達(dá)而抑制肝細(xì)胞的凋亡，減少缺血再灌注損傷，并促進(jìn)肝細(xì)胞再生。ROC曲線顯示，AT-Ⅲ在取最佳臨界值為16.4%時(shí)，判斷HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的敏感性和特異性分別達(dá)到了0.750和0.529；表明AT-Ⅲ可能與HBV-ACLF患者預(yù)后相關(guān)。MELD評(píng)分是經(jīng)典的評(píng)判不同終末期肝病預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)，MELD評(píng)分越高，肝病越嚴(yán)重，患者的臨床預(yù)后越差。本研究顯示，好轉(zhuǎn)組與未好轉(zhuǎn)組相比，MELD評(píng)分顯著降低，同時(shí)Spearman相關(guān)性分析顯示，AT-Ⅲ與MELD評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，采用MELD評(píng)分預(yù)測(cè)HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的曲線下面積為0.698，界值為28.5，其敏感度為76.5%，特異度為55.9%；AT-Ⅲ聯(lián)合MELD評(píng)分預(yù)測(cè)HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的曲線下面積為0.756，界值A(chǔ)T-Ⅲ：20.1%，MELD評(píng)分：25分，其敏感度為62.5%，特異度為88.2%，在評(píng)價(jià)HBV-ACLF患者臨床預(yù)后方面，與單獨(dú)MELD評(píng)分相比，AT-Ⅲ聯(lián)合MELD評(píng)分雖然略微降低了其敏感性，這可能是因?yàn)锳T-Ⅲ活性水平之只有在肝衰竭末期才顯著減低，卻大大提高了其特異性，以上結(jié)果進(jìn)一步提示了AT-Ⅲ在預(yù)測(cè)HBV-ACLF患者的預(yù)后方面具有重要意義。

綜上，AT-Ⅲ活性水平在HBV-ACLF患者中水平顯著降低，對(duì)診斷HBV-ACLF肝臟損傷程度及病情進(jìn)展具有重要臨床意義和應(yīng)用價(jià)值，臨床上聯(lián)合檢測(cè)TBIL、PTA、PT-INR和AT-Ⅲ對(duì)HBV-ACLF病情的進(jìn)展評(píng)估和預(yù)后的判斷具有一定的指導(dǎo)意義，MELD評(píng)分聯(lián)合AT-Ⅲ有可能作為預(yù)測(cè)HBV-ACLF患者臨床預(yù)后的新的參考指標(biāo)。同時(shí)由于受到本次研究樣本選擇的局限性及數(shù)量有限的影響，此結(jié)論需要后續(xù)進(jìn)一步的研究證實(shí)。