長鏈非編碼RNA PVT1對宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響

李 力，郭祥翠，王倩青，李 君，郜智慧

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌。在診斷時，大多數(shù)患者已經(jīng)處于疾病的中晚期，近幾年來，年輕患者的發(fā)病率逐年上升。因此，研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，尋找新的治療靶點，已成為宮頸癌研究的重點。近年來，隨著治療手段的進步，提高了患者的生存率和生活質量。然而，腫瘤復發(fā)和轉移仍然是宮頸癌患者死亡的主要原因。

生物信息學分析已確定漿細胞瘤變異易位1基因(plasmacytoma variant translocation 1, PVT1)是胃癌、肺癌、胰腺癌和宮頸癌等多種癌癥類型中少數(shù)關鍵功能性lncRNA之一。PVT1對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有調節(jié)作用，但是，潛在的機制尚未完全清楚。miR-484位于chr6上，最初被發(fā)現(xiàn)與癌癥對化療藥物的耐藥性有關。有研究表明miR-484在肝細胞癌的癌前病變中過表達，并且可以在促進肝細胞的轉化和肝癌的發(fā)展。因此，該研究通過探究長鏈非編碼RNA PVT1與miR-484靶向關系對宮頸癌細胞的影響，以期對宮頸癌的治療和預后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

PVT1 shRNA (sh-PVT1)(上海生工生物公司設計合成)；miR-484 inhibitor、Matrigel基質膠、Lipfectamine 3000轉染試劑盒(美國Invitrogen公司)；順鉑、胎牛血清、0.25%胰酶和DMEM細胞培養(yǎng)液、RIPA裂解液(美國Sigma公司)；BCA試劑(上海碧云天生物科技公司)；TRIzol試劑盒、反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒(美國ThermoFisher公司)；Transwell小室及人工基底膜(美國BD公司)；Ki-67、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、、E-cadherin和N-cadherin抗體(美國NEB公司)；HRP標記的山羊抗小鼠二抗(美國Santa Cruz公司)；Invitrogen E-Gel Imager凝膠成像儀(美國賽默飛公司)；Olympus CK30顯微鏡(日本奧林巴斯光學有限公司)。

1.2 腫瘤組織與細胞培養(yǎng)

癌組織與癌旁組織取自人子宮頸鱗癌組織及其周圍正常組織。宮頸癌細胞系在補充有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長。所有細胞均培養(yǎng)于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中。細胞匯合率達到85%以上時用0.25%胰酶進行消化傳代。

1.3 實驗方法

1.3.1

細胞轉染 將SiHa和MG63細胞傳代培養(yǎng)于6孔板中。24 h后，根據(jù)轉染試劑盒說明書用Lipofectamine 3000分別或同時轉染sh-PVT1和miR-484 inhibitor，48 h后進行相應檢測。

1.3.2

RT-PCR 用TRIzol試劑盒提取各組細胞總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，用PCR儀對cDNA進行擴增后用熒光定量試劑盒對進行定量分析。以GAPDH作為內參。反應條件為：95 ℃ 反應15 s，總共40個循環(huán)，最后60 ℃反應30 s，70 ℃反應30 s。用于該反應的引物信息見表1。

1.3.3

細胞增殖實驗 細胞增殖測定采用細胞增殖ELISA BrdU(比色)試劑盒(Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ)根據(jù)制造商的協(xié)議。轉染48 h后，1.0×10個細胞被鍍在96孔的培養(yǎng)皿中，并讓其附著一夜。細胞用BrdU標記2 h，固定，用抗BrdU-pod孵育。通過洗滌去除未結合的過氧化物酶偶聯(lián)物。然后加入底物，15 min后測量吸光度值(370～492 nm)。根據(jù)試劑盒說明，還使用了PrestoBlue1細胞存活率測定法。轉染48 h后，將細胞接種到96孔板(1.0×10細胞/孔)上，并以10～200 μmol/L的濃度范圍暴露于順鉑4 h。移除順鉑培養(yǎng)基并在暴露4 h后用生長培養(yǎng)基替換，然后在37 ℃下孵育過夜。第2天，用PrestoBlue1試劑將細胞在37 ℃孵育1 h后測量熒光值。

表1 實時定量PCR目的基因的引物

1.3.4

Western blot法 使用裂解緩沖液裂解細胞樣品。然后，使用BCA蛋白質測定試劑盒定量蛋白質濃度。含有20 mg蛋白質的樣品在10%SDS-PAGE中分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗 (PCVA, 1∶1 000; Ki67, 1∶1 000; VEGF, 1∶1 000; MMP-9, 1∶1 000; E-cadherin, 1∶1 000; N-cadherin, 1∶1 000) 于4 ℃封閉過夜，第2天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加電化學發(fā)光溶液,設置曝光參數(shù)，檢測目的條帶對應化學發(fā)光強弱。

1.3.5

熒光素酶報告實驗 對于熒光素酶測定，將SiHa和MG63(5×10細胞/孔)接種在24孔板中。 野生型pGL3-PVT1-WT和突變型pGL3- PVT1-Mut載體購自Genechem(中國上海)。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)將細胞用miR-484轉染48 h，然后與PVT1-WT或PVT1-Mut共轉染。根據(jù)熒光素酶檢測試劑盒說明書，在轉染后48 h內，通過雙重熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)檢測細胞的熒光素酶活性。海腎熒光素酶活性用作內部對照。

1.3.6

Transwell 用胰蛋白酶消化宮頸癌細胞，并重懸于含10%FBS的DMEM中。將4×10細胞輕輕地添加到Transwell的上層隔室。 將具有10% FBS或EGF的DMEM添加到Transwell的下部隔室。 將細胞置于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)指定時間。用棉球輕輕去除上面殘留的細胞。通過過濾器從上側遷移到下側的細胞用5%戊二醛固定10 min，然后用1%的結晶紫在2%乙醇中染色20 min。在顯微鏡下從5個不同的隨機選擇的視圖中計數(shù)下側的染色細胞。將5個顯微鏡視野的平均細胞數(shù)用作侵襲細胞數(shù)。

1.3.7

劃痕實驗 用劃痕法檢測癌細胞的遷移能力。細胞在培養(yǎng)皿中匯合后，用p1000塑料微吸管尖在細胞單層上劃出水平和垂直交叉線。用培養(yǎng)基輕輕清洗細胞表面，去除細胞碎片后，將原培養(yǎng)基吸出，用配制好的藥物和對照培養(yǎng)基代替。用Olympus CK30顯微鏡在同一框架和同一視野下，于0、24 h拍攝劃痕區(qū)域的快照圖像。圖像用ImageJ軟件進行分析，比較各組24 h/0 h劃痕寬度比。

1.3.8

免疫熒光檢測p38的細胞核轉位 將宮頸癌細胞接種到涂有纖連蛋白的玻璃蓋玻片上。培養(yǎng)24 h后，PBS沖洗細胞，固定于預冷甲醇中，0.2% Triton X-100滲透。固定細胞在1.5%的正常山羊血清中預孵育，4 ℃下用一抗p38 (1∶100) 孵育過夜。熒光素標記山羊抗兔IgG抗體37 ℃孵育后，將蓋玻片用PermaFluor Aqueous固定在載玻片上。使用Zeiss Axioplan Universal顯微鏡觀察熒光。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測PVT1和miR-484在癌組織和癌旁組織的表達

PVT1在宮頸癌組織中的表達是癌旁組織的2.5倍左右(

F

=2.375，

P

<0.05)，見圖1A。與相比，miR-484在癌旁組織中的表達是宮頸癌組織的2倍左右(

F

=1.163，

P

<0.05)，見圖1B。

圖1 PVT1和miR-484在癌組織和癌旁組織的表達

2.2 PVT1與miR-484的靶向關系

通過進行生物信息學分析，觀察到PVT1與miR-484存在結合位點，見圖2A。與對照組比較，sh-PVT1組PVT1表達水平顯著下降，而miR-484 inhibitor組PVT1表達水平顯著升高(

F

=522.5，

P

<0.05)；與miR-484 inhibitor組比較，sh-PVT1+inhibitor組細胞PVT1表達水平顯著降低，見圖2B。與對照組比較，sh-PVT1組miR-484表達水平(2.91±0.05)顯著升高，而miR-484 inhibitor組miR-484表達水平(0.19±0.04)顯著下降(

F

=8 801，

P

<0.05)；與miR-484 inhibitor組比較，sh-PVT1+inhibitor組細胞miR-484表達水平(0.13±0.17)顯著升高(

P

<0.05) ，見圖2C。熒光素酶報告實驗結果表明，與對照組比較，miR-484能顯著抑制PVT1野生質粒的熒光素酶活性 (

P

<0.05)；通過改變PVT1片段中假定的結合位點完全消除了抑制作用，見圖2D。結果表明PVT1與miR-484存在靶向關系。

2.3 干擾PVT1對宮頸癌生長的影響

與對照組比較，sh-PVT1組陽性細胞數(shù)顯著減少，miR-484 inhibitor組陽性細胞數(shù)顯著升高 (

F

=266.1，

P

<0.05)；與miR-484 inhibitor組比較：sh-PVT1+inhibitor組陽性細胞數(shù)顯著減少 (

P

<0.05)，見圖3A。與對照組比較，sh-PVT1組細胞增殖蛋白Ki67、PCNA表達水平均顯著降低(

P

<0.05)，而miR-484 inhibitor組Ki67、PCNA表達水平均顯著升高 (

F

=87.45，

P

<0.05；

F

=72.10，

P

<0.05) ；與miR-484 inhibitor組比較：sh-PVT1+inhibitor組Ki67、PCNA表達水平均顯著降低 (

P

<0.05)，見圖3B。結果表明干擾PVT1能抑制宮頸癌細胞的生長。

2.4 干擾PVT1對宮頸癌侵襲能力的影響

與對照組比較，sh-PVT1組侵襲細胞數(shù)顯著降低 (

P

<0.05)，而miR-484 inhibitor組侵襲細胞數(shù)顯著升高(

F

=18.17，

P

<0.05)；與miR-484 inhibitor組比較，sh-PVT1+inhibitor組侵襲細胞數(shù)顯著降低 (

P

<0.05) ，見圖4A。此外，如圖4B所示，與對照組比較，sh-PVT1組VEGF、MMP-9的表達水平顯著降低(

P

<0.05)；而miR-484 inhibitor組VEGF、MMP-9表達水平均顯著升高(

F

=9.33，

P

<0.05；

F

=42.47，

P

<0.05) ；與miR-484 inhibitor組比較，sh-PVT1+inhibitor組VEGF、MMP-9表達水平均顯著降低(

P

<0.05)。結果表明干擾PVT1能夠抑制宮頸癌細胞侵襲能力。

2.5 干擾PVT1對宮頸癌遷移能力的影響

與對照組比較，sh-PVT1組的24 h/0 h劃痕寬度比升高 (

P

<0.05)，而miR-484 inhibitor組的24 h/0 h劃痕寬度比降低 (

F

=35.48，

P

<0.05)；與miR-484 inhibitor組比較，sh-PVT1+inhibitor組的24 h/0 h劃痕寬度比升高(

P

<0.05)，見圖5。結果表明干擾PVT1能夠抑制宮頸癌細胞遷移能力。

2.6 干擾PVT1對上皮-間質轉化的影響

干擾PVT1使細胞發(fā)生表皮間質轉化，導致了細胞形態(tài)的改變，見圖6A。與對照組比較，sh-PVT1組E-cadherin的表達水平升高 (

P

<0.05)；miR-484 inhibitor 組E-cadherin表達水平均降低(

F

=125.7，

P

<0.05)；與miR-484 inhibitor組比較，sh-PVT1+inhibitor組E-cadherin表達水平均升高(

P

<0.05) ，見圖6B。相反，與對照組比較，sh-PVT1組N-cadherin的表達水平下降(

P

<0.05)；miR-484 inhibitor組N-cadherin表達水平均升高(

F

=67.19，

P

<0.05) ；與miR-484 inhibitor組比較，sh-PVT1+inhibitor組N-cadherin表達水平均下降(

P

<0.05)，見圖6B。結果表明干擾PVT1 能夠影響上皮-間質轉化相關分子的蛋白水平變化，介導宮頸癌細胞發(fā)生上皮間質轉化，抑制了宮頸癌細胞侵襲和遷移能力的增加。

圖2 PVT1與 miR-484的靶向關系

圖3 干擾PVT1對細胞增殖及相關蛋白表達的影響

圖4 干擾PVT1對細胞侵襲能力及相關蛋白表達的影響

圖5 細胞劃痕實驗×200

2.7 干擾PVT1對p38MAPK活化的影響

與對照組比較，sh-PVT1組p38磷酸化水平降低 (

P

<0.05)，miR-484 inhibitor組p38磷酸化水平增加(

F

=39.81，

P

<0.05) ；與miR-484 inhibitor組比較，sh-PVT1+inhibitor組p38磷酸化水平降低(

P

<0.05)，見圖7A。免疫熒光染色法實驗表明，對照組細胞的細胞質中有p38激酶蛋白熒光弱熒光表達，p38蛋白熒光變弱，細胞核中沒有明顯顯現(xiàn)；miR-484 inhibitor組的p38蛋白熒光變強，區(qū)域幾乎分布于整個細胞，細胞核中亦有明顯顯現(xiàn)，見圖7B。結果表明干擾PVT1能夠抑制P38MAPK的活化。

圖6 干擾PVT1對細胞遷移能力及相關蛋白表達的影響

圖7 干擾PVT1對P38MAPK磷酸化及細胞核轉位的影響

3 討論

宮頸癌的發(fā)病率在全球女性惡性腫瘤中排名第四，而超過85%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家，每年估計有275 000人死亡。宮頸癌也是我國女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，威脅著我國女性生殖系統(tǒng)的健康。淋巴結轉移、器官轉移和腫瘤復發(fā)是誘導宮頸癌引起死亡的主要原因，宮頸癌治療對醫(yī)療健康事業(yè)是一個重大考驗。

PVT1是宮頸癌中的一種致癌lncRNA,可通過調控miRNA表達發(fā)揮致癌作用。lncRNA PVT1確切的生物起源尚不清楚，但其與細胞分化、轉移性疾病、總生存率和腫瘤分期等因素的關系已被廣泛研究。研究表明miRNA是多種生物學過程的重要調控因子，其異常表達與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關。有研究顯示miR-484與癌癥中對化療藥物的耐藥性有關。本研究結果顯示，PVT1在宮頸癌組織中表達上調，在宮頸癌中發(fā)揮了促癌作用；與癌旁組織相比，宮頸癌癌組織中miR-484表達下調。這些差異可能是由于不同類型的癌癥和癌的分期，但其機制還有待進一步闡明。

lncRNA和miRNA之間能進行相互調節(jié)。從機制上講，lncRNA可以作為miRNA的競爭性內源RNA，而miRNA可以通過Argonaute 2(Ago2)介導的途徑抑制lncRNA的表達。PVT1可通過調控多種miRNA的表達影響癌癥的發(fā)展，但目前尚未有研究證實PVT1能否通過靶向調控抑癌基因miR-484的表達影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結果顯示miR-484在宮頸癌細胞中表達明顯降低，這與Hu et al的研究一致。解除PVT1對miR-484的抑制作用，恢復了其正常表達。用miR-484 inhibitor抑制miR-484表達后，sh-PVT1對miR-484表達的促進作用明顯減弱，提示PVT1和miR-484之間可能存在靶向調控關系。生物信息預測結果表明PVT1上存在miR-484的結合位點，熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，miR-484過表達可明顯減弱PVT1野生質粒的熒光素酶活性，進一步表明miR-484可與PVT1結合，PVT1與miR-484之間存在靶向調控關系。

癌細胞無限增殖是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要機制。已有研究表明PVT1高表達促進宮頸癌細胞增殖，miR-484過表達顯著抑制細胞增殖。Zhang et al研究表明PVT1高表達使EdU陽性細胞百分率升高，而低PVT1表達使EdU陽性細胞百分率降低。本研究表明干擾PVT1使Brdu陽性細胞數(shù)降低，而抑制miR-484使Brdu陽性細胞數(shù)升高。干擾PVT1表達后，宮頸癌細胞增殖受到明顯抑制，Ki67和PCNA的蛋白表達水平降低，而通過抑制miR-484表達可部分恢復PVT1沉默引起的宮頸癌細胞的增殖受抑，說明干擾PVT1抑制宮頸癌細胞增殖與miR-484的過表達有關。

腫瘤侵襲和遷移是復雜的多步轉移過程的重要組成部分。目前許多研究表明，干擾PVT1均減少細胞的遷移和侵襲，而過表達PVT1則增加遷移和侵襲，而miR-484高表達抑制宮頸癌細胞遷移、侵襲。本研究表明干擾PVT1能明顯降低宮頸癌細胞的侵襲數(shù)量，減少宮頸癌細胞的遷移，并能抑制VEGF、MMP9蛋白表達水平，同時，抑制miR-484表達使得sh-PVT1對宮頸癌細胞侵襲、遷移的抑制作用明顯減弱，表明干擾PVT1抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移與高表達的miR-484有關。

EMT是一種與遷移和侵襲相關的重要機制。在轉化過程中，增強細胞與細胞接觸的上皮標志物的表達減少，而間充質標志物表達減少。Hu et al研究表明miR-484過表達顯著下調E-cadherin表達水平，抑制宮頸癌細胞EMT過程。本研究表明干擾PVT1能明顯抑制E-cadherin 的蛋白表達水平，而顯著增強了N-cadherin的蛋白表達水平。同時抑制miR-484表達明顯減弱sh-PVT1對宮頸癌細胞EMT過程的抑制作用，提示干擾PVT1抑制宮頸癌細胞EMT過程與其上調miR-484的表達有關。

P38MAPK信號轉導通路是細胞內介導細胞外刺激的重要信號系統(tǒng)，在細胞惡變和腫瘤侵襲起著關鍵作用。p38MAPK信號通路作為MAPK家族的重要通路，對包括乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌在內的癌細胞的侵襲和遷移具有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)抑制p38MAPK通路可限制乳腺癌轉移，影響卵巢癌大鼠腫瘤的生長。Gan et al研究表明抑制ZEB1-AS1可阻斷p38MAPK信號通路，最終抑制EMT，抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲。本研究表明干擾PVT1可顯著下調p-p38的表達，p38的核染色強度明顯減弱；抑制miR-484上調了p-p38的表達，p38的核染色強度明顯增強，這與Gan et al的研究結果一致，說明干擾PVT1能抑制p38MAPK的活化。