長(zhǎng)效穩(wěn)定表達(dá)桿狀病毒基因傳遞載體的構(gòu)建及表達(dá)效率研究

王志昇，李夢(mèng)婷，姬勇敢，楊 文，楊 麗，楊萌萌

近年來，桿狀病毒作為基因傳遞載體吸引了眾多研究者的關(guān)注。然而，由于其介導(dǎo)的外源基因無法整合到宿主染色體中，隨著傳代次數(shù)的增多，外源基因逐漸降解，導(dǎo)致無法長(zhǎng)效表達(dá)目的蛋白，限制了其作為基因傳遞載體的廣泛應(yīng)用。研究表明，睡美人(sleeping beauty, SB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，通過以經(jīng)典的DNA“剪切-粘貼”模式，能夠?qū)⑼庠椿蛘系剿拗骰蚪M中特異性的位點(diǎn)中?；谝陨戏治?，為了克服桿狀病毒瞬時(shí)表達(dá)的缺陷，該研究擬構(gòu)建SB轉(zhuǎn)座子-桿狀病毒嵌合載體系統(tǒng)，以綠色熒光蛋白基因EGFP作為靶基因，以此來評(píng)價(jià)SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)的桿狀病毒作為基因傳遞載體在哺乳動(dòng)物體內(nèi)外的表達(dá)效率。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞

pFastBac DUAL表達(dá)質(zhì)粒購自美國(guó)Thermo公司；pT2/HB、pCMV(CAT)T7-SB100質(zhì)粒購自美國(guó)Addgene公司；人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞和昆蟲Sf-9細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫。Sf-9細(xì)胞在Grace昆蟲培養(yǎng)基(包含10% FBS、3.3 g/L酵母提取物和水解乳蛋白)，27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；U87細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基(10% FBS、1%青鏈霉素)，37 ℃、5% CO潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c裸小鼠，4～6周齡，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(寧)2020-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度(22±1)℃、濕度(50±5)%、12 h/12 h晝夜交替的SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)室中。

1.3 主要試劑

Taq 酶、限制核酸內(nèi)切酶和T4連接酶購自美國(guó)Thermo公司；CloneExpressUltra One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物公司；質(zhì)粒小提試劑盒與凝膠回收試劑盒購自北京天根公司；丁酸鈉購自美國(guó)Sigma公司；MTT試劑盒購自江蘇凱基生物；DMEM培養(yǎng)基、Grace培養(yǎng)基、FBS及脂質(zhì)體購自美國(guó)Gibco公司；兔抗EGFP多克隆抗體、Cy3-山羊抗兔熒光二抗、DAPI染液、抗熒光淬滅封片劑和EDTA(pH8.0)抗原修復(fù)液購自武漢谷歌生物。

1.4 主要儀器

T100型PCR儀購自美國(guó)BIORAD公司；Multiskan FC型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀和Forma 311型CO培養(yǎng)箱購自美國(guó)Thermo公司；Axio Vert.A1型倒置熒光顯微鏡購自德國(guó)蔡司公司；CI-L型正置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；5430R型高速冷凍離心機(jī)購自美國(guó)Eppendorf公司；CytoFLEX FCM型流式細(xì)胞儀購自美國(guó)貝克曼公司；石蠟切片系統(tǒng)購自德國(guó)徠卡公司。

1.5 引物設(shè)計(jì)

構(gòu)建長(zhǎng)效穩(wěn)定表達(dá)桿狀病毒基因傳遞載體所需的引物、序列、擴(kuò)增片段以及每條引物引入的酶切位點(diǎn)(下劃線所示)如表1所示。

1.6 載體構(gòu)建

1.6.1

pBac-CE質(zhì)粒的構(gòu)建 在pFastBac DUAL質(zhì)粒pPh啟動(dòng)子下游插入pCMV-IE-EGFP表達(dá)原件；pCMV-IE-EGFP融合基因通過引物CE-F/CE-R，從pEGFP-C1質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得，預(yù)期擴(kuò)增的pCMV-IE-EGFP大小為1 300 bp。經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pBac-CE。具體引物序列、酶切位點(diǎn)及擴(kuò)增的片段如表1所示。

1.6.2

pBacSB-CE質(zhì)粒的構(gòu)建 CMV-SB100X-SV40 PA表達(dá)原件通過引物CMV-SB-SV-F/CMV-SB-SV-R從質(zhì)粒pCMV(CAT)T7-SB100中擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)同樣位點(diǎn)酶切后的pFastBac Dual根據(jù)CloneExpressUltra One Step Cloning Kit手冊(cè)同源重組，獲得的質(zhì)粒命名為pBac-SB100X，預(yù)期擴(kuò)增的CMV-SB100X-SV40 PA融合基因大小約為2.1 kb；CMV-EGFP-SV40 PA表達(dá)原件通過引物CE-SV-F/CE-SV-R從質(zhì)粒pBac-CE中擴(kuò)增，然后與經(jīng)

Eco

RV和

Bgl

Ⅱ雙酶切后的pT2/HB按照同樣的方法進(jìn)行同源重組，獲得的質(zhì)粒命名為pT2/HB-CE，預(yù)期擴(kuò)增的CMV-EGFP-SV40 PA融合基因大小約為1.6 kb；IR/DR-CMV-EGFP-SV40 PA-IR/DR表達(dá)原件通過引物IR/DR-CE-F和IR/DR-CE-R從質(zhì)粒pT2/HB-CE中擴(kuò)增，然后與Not Ⅰ和Avr Ⅱ雙酶切后的pBac-SB100X經(jīng)同源重組獲得重組質(zhì)粒pBacSB-CE，預(yù)期擴(kuò)增的IR/DR-CMV-EGFP-SV40 PA-IR/DR融合基因大小約為2.3 kb。

1.7 重組病毒粒子的獲得

依據(jù)Bac-to-Bac(invitrogen)說明書方法將pBac-CE和pBacSB-CE轉(zhuǎn)化DH10Bac，提取經(jīng)藍(lán)白斑篩選后的陽性菌落DNA，即Bacmid DNA，然后將Bacmid DNA用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Sf-9昆蟲細(xì)胞(9×10個(gè)/ml)，27 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)大量綠色熒光時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，作為原毒種P1代毒，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為1繼續(xù)接種Sf-9細(xì)胞，收集上清液作為P2代毒，繼續(xù)接種獲得P3代毒，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。獲得的病毒分別命名為Bac-CE和BacSB-CE，病毒的滴度通過終點(diǎn)稀釋法測(cè)定。

1.8 重組桿狀病毒對(duì)U87細(xì)胞活力的影響

桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法參照文獻(xiàn)。簡(jiǎn)述如下，將U87細(xì)胞懸液按4×10/ml的細(xì)胞密度，每孔100 μl接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將Bac-CE和BacSB-CE分別以MOI 100、200、400 轉(zhuǎn)導(dǎo)U87細(xì)胞，對(duì)照組為不含病毒的空轉(zhuǎn)導(dǎo)組，72 h后，每孔加入50 μl 1×MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，加入150 μl DMSO終止反應(yīng)，然后通過酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(optical density, OD)。細(xì)胞存活率(%)=OD/OD×100%

1.9 重組桿狀病毒在U87細(xì)胞中的表達(dá)效率

將100 MOI Bac-CE和BacSB-CE按照上述的方法分別轉(zhuǎn)導(dǎo)U87細(xì)胞，每隔3 d在倒置熒光顯微鏡下記錄發(fā)熒光細(xì)胞比例，并收集細(xì)胞，一部分細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，另一部分細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP總熒光強(qiáng)度(total fluorescence intensity, TFI)，每個(gè)樣本檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞。TFI=細(xì)胞總數(shù)×陽性細(xì)胞百分比×平均熒光強(qiáng)度。

1.10 重組桿狀病毒在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

取200 μl生長(zhǎng)狀態(tài)良好的U87細(xì)胞懸液(1×10個(gè)/ml)接種在BALB/c裸小鼠背部左側(cè)皮下，當(dāng)腫瘤體積長(zhǎng)至100 mm時(shí)，隨機(jī)分為兩組，每組9只，分別瘤內(nèi)注射200 μl Bac-CE和BacSB-CE(1×10pfu/ml)，于注射后第1、5和10天每組分別處死3只，分離腫瘤組織，制作石蠟切片，經(jīng)脫蠟水化處理后，加入兔抗EGFP多克隆抗體4 ℃過夜孵育，然后加入Cy3-山羊抗兔熒光二抗室溫孵育1 h后，PBS清洗3次，DAPI染液室溫避光復(fù)染10 min，用抗熒光淬滅封片劑封片，于正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

表1 擴(kuò)增片段引物序列

2 結(jié)果

2.1 桿狀病毒基因傳遞載體構(gòu)建模式圖

以pFastBac-DUAL質(zhì)粒為骨架，在pPh啟動(dòng)子下游插入pCMV-IE-EGFP表達(dá)原件，獲得的重組質(zhì)粒命名為pBac-CE；將pPh啟動(dòng)子替換為pCMV-SB100X-PA-IR/DR-pCMV-IE-EGFP-PA-IR/DR表達(dá)原件，獲得的重組質(zhì)粒命名為pBacSB-CE，載體構(gòu)建模式圖如圖1所示。

2.2 重組質(zhì)粒PCR鑒定

重組質(zhì)粒pBac-CE和pBacSB-CE分別用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳在預(yù)期的位置處均出現(xiàn)了特異性條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致，證明已成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBac-CE和pBacSB-CE。

圖1 以質(zhì)粒pFastBac Dual為骨架構(gòu)建的重組桿狀病毒基因傳遞載體模式圖

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.3 重組Bacmid PCR鑒定

將pBac-CE和pBacSB-CE轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac，然后從陽性菌落中提取病毒DNA，經(jīng)PCR和核酸瓊脂糖凝膠電泳鑒定，均在預(yù)期位置處出現(xiàn)了插入的片段(圖3)，證明目的片段已成功插入病毒基因組中。

圖3 重組Bacmid PCR鑒定

2.4 重組桿狀病毒對(duì)U87細(xì)胞活力的影響

為了證實(shí)重組病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的安全性，將不同滴度的BacSB-CE和Bac-CE分別轉(zhuǎn)導(dǎo)U87細(xì)胞，3 d后通過MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率。結(jié)果如圖4所示，病毒感染復(fù)數(shù)是100、200、400 MOI時(shí)，BacSB-CE和Bac-CE組的細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明重組桿狀病毒對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無影響。

圖4 重組桿狀病毒對(duì)U87細(xì)胞活力的影響

2.5 重組桿狀病毒在U87細(xì)胞中的表達(dá)效率

為了驗(yàn)證重組病毒BacSB-CE在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)效率，將100 MOI重組病毒BacSB-CE和Bac-CE分別轉(zhuǎn)導(dǎo)U87細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后每隔3 d在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光狀態(tài)。結(jié)果如圖5A所示，隨著時(shí)間的增加，熒光細(xì)胞的數(shù)目逐漸減少，到第15天的時(shí)候，Bac-CE組已基本上看不到熒光細(xì)胞，而BacSB-CE組則仍可看到熒光直至實(shí)驗(yàn)期結(jié)束(60 d)。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP TFI，結(jié)果如圖5B所示，BacSB-CE組能持續(xù)檢測(cè)到熒光信號(hào)(約10a.u.)直至實(shí)驗(yàn)期結(jié)束(60 d)，而Bac-CE組在15 d之后下降到低于檢測(cè)限(10～10)a.u.，結(jié)果表明SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的桿狀病毒能夠有效延長(zhǎng)外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。

圖5 重組桿狀病毒在U87細(xì)胞中的表達(dá)效率

圖6 組織免疫熒光分析重組桿狀病毒介導(dǎo)的EGFP在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 ×100

2.6 重組桿狀病毒在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

為了評(píng)估重組病毒BacSB-CE在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，建立裸鼠皮下膠質(zhì)瘤模型，通過組織免疫熒光檢測(cè)EGFP在腫瘤內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果如圖6所示，在注射后的第1天，BacSB-CE和Bac-CE組，都能檢測(cè)到熒光細(xì)胞，在第5天的時(shí)候Bac-CE組基本看不到熒光細(xì)胞，而BacSB-CE組在第10天時(shí)仍能檢測(cè)到發(fā)熒光的細(xì)胞。這些結(jié)果表明，SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的重組病毒能有效地提高外源基因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

3 討論

桿狀病毒由于對(duì)人和哺乳動(dòng)物不具備感染性，因此無針對(duì)桿狀病毒的特異免疫原性，而且能夠容納至少50 kb以上的外源片段插入以及重組病毒的獲得簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，使得桿狀病毒在疫苗生產(chǎn)、真核蛋白表面展示等方面的報(bào)道屢見報(bào)端。近年來，越來越多的研究表明，在合適的功能啟動(dòng)子作用下，桿狀病毒能將外源基因有效地轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，使得桿狀病毒作為基因傳遞載體的應(yīng)用時(shí)有報(bào)道。然而，桿狀病毒的基因組在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸被降解，外源基因無法持續(xù)表達(dá)，限制了其在該領(lǐng)域中的進(jìn)一步應(yīng)用。

為了克服桿狀病毒在哺乳動(dòng)物體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)的缺陷，本研究以pFastBac DUAL質(zhì)粒為骨架，構(gòu)建了含有SB轉(zhuǎn)座子的嵌合桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(圖1～3)，并證實(shí)了重組病毒載體攜帶

EGFP

基因?qū)87細(xì)胞的增殖沒有影響(圖4)，說明重組病毒對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)無副作用。進(jìn)一步研究表明，在SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的作用下，BacSB-CE可明顯延長(zhǎng)EGFP在U87細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)間(>60 d，本實(shí)驗(yàn)只設(shè)計(jì)了60 d)，而對(duì)照組Bac-CE在第15天的時(shí)候已基本看不到熒光細(xì)胞(圖5A)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖5B)也表明，BacSB-CE和Bac-CE組在轉(zhuǎn)導(dǎo)初始都有很高的表達(dá)效率，而隨著時(shí)間的增加，二者的表達(dá)率急劇下降，在15 d之后BacSB-CE組仍能穩(wěn)定檢測(cè)到約10a.u的TFI，而Bac-CE組已經(jīng)降到檢測(cè)下限(10～10a.u.)。這個(gè)結(jié)果可能由于大量外源基因失敗整合到宿主基因組中，并且隨著傳代次數(shù)的增加，外源基因逐漸被降解、稀釋，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的急劇下降。體內(nèi)裸鼠膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了SB轉(zhuǎn)座子可以提高外源基因EGFP在體內(nèi)的表達(dá)效率(圖6)。這些結(jié)果說明在SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的介導(dǎo)下，外源基因成功整入到了宿主細(xì)胞的基因組中，并隨著宿主細(xì)胞的增殖而穩(wěn)定表達(dá)。這與Pan et al的研究結(jié)果一致。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，oriP/EBNA1，AAVITR等重組嵌合桿狀病毒載體均被開發(fā)，這些載體均可不同程度的延長(zhǎng)外源蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)間。為了提高病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，除了優(yōu)化載體設(shè)計(jì)外，轉(zhuǎn)導(dǎo)條件也應(yīng)考慮，如根據(jù)細(xì)胞的不同，可以將病毒和細(xì)胞的孵育時(shí)間增加到4～6 h；最好在26～27 ℃條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)，37 ℃可能會(huì)破壞病毒的完整性；添加3 mmol/L丁酸鈉(高濃度的丁酸鈉對(duì)細(xì)胞有毒性)等，這些都可有效地提高病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。