抑癌基因PDCD4的表達對南蛇藤提取物抑制人胃癌裸鼠移植瘤生長的影響

巴 赫，彭 強，朱耀東

近年來胃癌已儼然成為威脅人類健康的重要疾病之一。中醫(yī)藥是我國腫瘤防治工作中的重要組成部分，具有獨特的優(yōu)勢與特色。因此篩選和開發(fā)具有抗胃癌作用的中藥具有重要的醫(yī)藥價值和社會意義。南蛇藤性味辛溫，有微毒，歸屬肝經(jīng)、膀胱經(jīng)，具有祛風(fēng)、活血、消腫、止痛、解毒等功效。前期研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤提取物(

Celastrus

Orbiculatus

extract, COE)可有效抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生長，其機制可能與抑制腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions, EMT)的發(fā)生有關(guān)。程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)是一種抑癌基因，可以通過抑制蛋白質(zhì)的翻譯起到抑制腫瘤作用。課題組長期致力于PDCD4與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制方面的研究。前期研究表明PDCD4可能參與COE對大鼠胃癌前病變發(fā)生的抑制作用，然而其在COE抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤生長中的作用尚不完全清楚。該研究擬通過建立高表達PDCD4的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細胞株，進一步探討抑癌基因PDCD4的表達變化在COE抑制人胃癌裸鼠荷瘤模型生長中的作用，為開發(fā)新型的抗腫瘤藥物提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

藥物 南蛇藤中藥飲片，批號070510，購于廣州致信藥業(yè)有限公司。COE的制備方法已獲得國家發(fā)明專利。主要流程如下：將南蛇藤莖飲片切斷，粉碎成粉，95%乙醇加熱回流提取3次，回收溶劑至干，加水分散后，用石油醚和乙酸乙酯分別萃取3次，回收溶劑后減壓濃縮并進行真空凍干，得到COE。

1.1.2

細胞株及動物 人胃癌細胞株SGC-7901購于中國科學(xué)院上海細胞庫。35只BALB/C無胸腺裸鼠，SPF級，6周齡，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK (京) 2016～0006，在安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障系統(tǒng)輔以潔凈層流柜環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.1.3

儀器 Heracell150i型CO培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；ChemiDoc XRS+型全自動化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Power/Pac300型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、Trans-blot SD型轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.1.4

試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司，批號分別為1517544、10270)；0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司，批號為J140028)；質(zhì)粒由課題組前期構(gòu)建，在實驗室留存；兔抗人GAPDH一抗(美國Stanta Cruz公司,批號SC32233)；兔抗人PDCD4一抗、兔抗人E-cadherin一抗、兔抗人N-cadherin一抗、兔抗人Vimentin一抗(英國Abcam公司，批號分別為：ab76055、AF4039、AP2739B、GR106729-14)；山羊抗兔HRP標記免疫球蛋白(Ig)G二抗(美國EarthOx公司，批號E03012001)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(日本Takara公司，批號RR047A、RR430A)ECL檢測試劑盒(沈陽萬類生物科技有限公司，批號WLA003)；PVDF膜(美國Millipore公司，批號IPVH00010)；基質(zhì)膠(美國Corning公司，批號356234)；DBA試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號DAB2031)。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養(yǎng) 人胃癌SGC-7901細胞株置于37 ℃、 5%CO的細胞培養(yǎng)箱中用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每2～3 d采用胰蛋白酶對細胞進行傳代處理，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細胞株建立 參照說明書，用lipofectamine 2000將真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-PDCD4轉(zhuǎn)染至人胃癌細胞系SGC-7901。轉(zhuǎn)染后采用G418篩選陽性克隆，并且繼續(xù)培養(yǎng)。用Western blot及RT-PCR法檢測PDCD4基因蛋白及mRNA的表達。

1.2.3

Western blot檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h后的SGC-7901胃癌細胞，加入RIPA裂解液進行裂解，提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行測定，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)到PVDF膜，脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，加入PDCD4一抗(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，PBST緩沖液漂洗3次，加入二抗(1∶5 000)，37 ℃反應(yīng)1 h，用ECL試劑盒顯影，以GAPDH作為對照，用Image J軟件對條帶灰度值進行分析。

1.2.4

RT-PCR法檢測 通過TRIzol法提取總RNA，通過分光光度計法檢測RNA的完整性，符合逆轉(zhuǎn)錄實驗要求后根據(jù)cDNA合成試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、30 min，98 ℃、5 min，-20 ℃保存。而后以cDNA為模板，與基因特異性引物進行PCR擴增PDCD4,而后進行相對定量分析。

1.2.5

裸鼠皮下移植瘤模型的建立 取對數(shù)生長期胃癌細胞，用生理鹽水調(diào)整細胞密度至1×10/ml，隨機分為正常組、對照組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-PDCD4組、COE組[40 mg/(kg·d)]、pcDNA3.1+COE組、pcDNA3.1-PDCD4+COE組，每組5只，于每只裸鼠右側(cè)脅部皮下注射0.2 ml。接種時局部出現(xiàn)皮丘，待皮下可觸及腫塊，隆起于皮膚表面，呈不規(guī)則狀，邊界清楚，直徑大約3～4 mm，提示裸鼠人胃癌皮下移植瘤模型建立成功。COE組給予灌胃給藥，連用3周，每次0.2 ml，其余各組灌注等量的生理鹽水。給藥過程中每天定時觀察裸鼠精神狀態(tài)、活動、飲食等一般情況。

1.2.6

腫瘤體積及質(zhì)量測定 從給藥當(dāng)天開始，每隔2 d稱量并記錄裸鼠體質(zhì)量，并用游標卡尺測量移植瘤的長徑(a)及與之垂直的短徑(b)，計算腫瘤體積(V=a×b/2)，繪制移動瘤的生長曲線。治療結(jié)束后次日，頸椎脫臼處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織，稱取瘤重，并計算其抑瘤率，抑瘤率=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.2.7

免疫組化法檢測 取腫瘤組織，切片脫蠟水化，利用HO溶液處理以消除內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，10%山羊血清封閉30 min，加入一抗(PDCD4, 1∶400；E-cadherin,1∶200；N-cadherin，1∶500；Vimentin，1∶500)，4 ℃孵育過夜，用PBS緩沖液沖洗3次，加入二抗，37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片。在400倍鏡下隨機選取5個視野，通過Image-Pro Plus 6.0軟件對切片的著色強度進行分析，測定積分吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PDCD4蛋白和mRNA表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，pcDNA3.1-PDCD4組PDCD4蛋白表達量增加(

P

<0.05)，pcDNA3.1組PDCD4蛋白表達量無變化。見圖1。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，pcDNA3.1-PDCD4組PDCD4 mRNA表達量增加(

P

<0.05)，pcDNA3.1組PDCD4 mRNA表達量無變化，提示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PDCD4 cDNA的SGC-7901細胞株構(gòu)建成功。見圖2。

2.2 COE對胃癌裸鼠皮下移植瘤模型生長的影響

pcDNA3.1-PDCD4組、COE組、pcDNA3.1+COE組、pcDNA3.1-PDCD4+COE組移植瘤生長受到抑制，腫瘤體積以及質(zhì)量均降低(

P

<0.05)，4組的抑瘤率分別為59.29%、57.52%、58.41%、71.68%。其中pcDNA3.1-PDCD4+COE組抑瘤率高于其余組(

P

<0.01)。見圖3、表1。

圖1 Western blot法監(jiān)測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SGC-7901細胞中PDCD4蛋白表達

圖2 RT-PCR法檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SGC-7901細胞中PDCD4 mRNA表達表達水平

圖3 COE對裸鼠皮下移植瘤模型中移植瘤體積的影響

表1 COE對裸鼠皮下移植瘤模型中移植瘤重量的影響

2.3 COE對腫瘤組織中蛋白表達的影響

pcDNA3.1-PDCD4組、COE組、pcDNA3.1+COE組、pcDNA3.1-PDCD4+COE組中PDCD4、E-cadherin的蛋白表達水平較對照組上調(diào)(

P

<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平下調(diào)(

P

<0.05);其中pcDNA3.1-PDCD4+COE組中上述4種蛋白表達水平變化幅度更大(

P

<0.01)。見圖4、表2。

3 討論

近年來，以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，與現(xiàn)代最前沿的醫(yī)學(xué)理論和研究成果相結(jié)合，從具有抗腫瘤作用的單味中藥或復(fù)方中，篩選具有防治胃癌的藥物，深入研究其作用機制，有著非常重要的意義。既體現(xiàn)了中醫(yī)藥簡、便、驗、廉的特色優(yōu)勢，又為胃癌預(yù)防藥物的研究提供了廣闊的藥物資源。EMT指在某些刺激因素作用下上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的過程，主要表現(xiàn)為上皮細胞失去極性，從原有的緊密連接狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⒐铝⒌臓顟B(tài)并獲得較強的運動和遷移能力。EMT在胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)等生命活動中具有重要作用，并與器官纖維化及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。其主要的分子特征包括：上皮標志因子如E-cadherin等表達減弱，N-cadherin、vimentin等間質(zhì)細胞標志物表達上調(diào)。近年來研究表明EMT作用增強可以賦予腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力并促進腫瘤細胞增殖。在前期研究中顯示COE可以通過減弱EMT作用對胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移起到抑制作用，本研究中觀察到用COE對胃癌移植瘤裸鼠模型進行治療后可以減緩移植瘤生長并上調(diào)E-cadherin表達，抑制N-cadherin、Vimentin表達，與前期研究結(jié)果一致，證實COE可以通過抑制EMT過程起到抗胃癌作用。此外，該研究還表明COE可以上調(diào)PDCD4蛋白表達水平。

表2 COE對腫瘤組織中PDCD4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平的影響

圖4 COE對腫瘤組織中PDCD4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響 免疫組化 ×400

PDCD4是一種高度保守的蛋白，可以通過其MA-3結(jié)構(gòu)域與真核翻譯起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor 4 A，eIF4A)結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。已有多項研究發(fā)現(xiàn)PDCD4可以通過抑制EMT過程對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。Hu et al發(fā)現(xiàn)PDCD4可以通過下調(diào)EMT通路激活因子EIF3H表達減弱EMT作用，抑制胃腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移；Ji et al發(fā)現(xiàn)敲除PDCD4后肝癌細胞的EMT作用增強，并獲得更強的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。本研究中，通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PDCD4質(zhì)粒提高SGC-7901胃癌細胞PDCD4表達水平后發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達增強，N-cadherin、Vimentin表達減弱，移植瘤生長受到抑制；提高PDCD4表達水平可以增強COE對EMT的抑制作用及其抗胃癌活性，表明COE通過上調(diào)PDCD4表達抑制EMT過程而對胃癌移植瘤的生長起到抑制作用。

綜上，PDCD4可以通過減弱胃癌細胞的EMT作用參與COE抗胃癌過程。

miR

-21是一種內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，位于PDCD4的上游，且已被證實與EMT的發(fā)生相關(guān)。接下來將對

miR

-21在COE抑制胃癌過程中扮演的角色進行探究，以更好地了解COE防治胃癌的具體機制以及作用靶點，為COE對胃癌的防治提供參考和指導(dǎo)。