亞抑菌濃度抗生素對高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因表達(dá)的影響

宋國濱，王 剛，黃 穎，吳文娟，徐元宏

高毒力肺炎克雷伯菌(

hypervirulent

Klebsiella

pneumoniae

,

hvKP

)及其相關(guān)的研究受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。但是目前，臨床醫(yī)生在治療該菌引起的感染時，由于不合理應(yīng)用抗生素，進(jìn)入患者體內(nèi)的抗生素濃度受到許多因素影響，比如指征使用是否合理、品種選擇是否合理、時機(jī)使用是否合理，另外還與用藥劑量、用藥部位、用藥方式以及患者自身消化吸收能力密切相關(guān)。因此，在這些因素的影響下導(dǎo)致進(jìn)入患者體內(nèi)的濃度不足以殺滅病原菌，而且亞抑菌濃度抗生素會顯著影響菌株的病原學(xué)行為，這種影響也會隨著抗生素的不同而有所變化。有研究表明，氧氟沙星、紅霉素在亞抑菌濃度對空腸彎曲菌的作用下，不僅不能抑制病原菌繁殖，反而可以使繁殖更加活躍，合成釋放毒素更加明顯。該研究對

hvKP

在亞抑菌濃度抗生素作用下，研究2種毒力基因——

rmpA

、

aerobactin

的表達(dá)水平，為臨床合理應(yīng)用抗生素、更好地治療患者提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2018年1月—12月的

hvKP

共57株。剔除同一患者相同部分的重復(fù)菌株。大腸埃希菌ATCC8739為質(zhì)譜鑒定實驗質(zhì)控菌株，肺炎克雷伯菌(

Klebsiella

pneumoniae

,

KP

)質(zhì)控細(xì)菌為ATCC700603,為本實驗室保存。

1.2 實驗儀器及試劑

高速冷凍離心機(jī)(上海力新儀器有限公司)；GeneAmp970基因擴(kuò)增儀(美國PE公司)；C-880V CO孵箱、紫外線凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；VITEK MS質(zhì)譜儀(法國梅里埃公司)；抗菌藥物(英國OXOID公司)；瓊脂糖、引物(上海生工生物股份有限公司)；標(biāo)志物DNA Marker、Premix TaqTM(日本TaKaRa公司)；VITEK MS CHCA基質(zhì)液(法國梅里埃公司)；哥倫比亞血平板(合肥天達(dá)診斷試劑有限公司)；Muller-Hinton瓊脂(江門市凱林貿(mào)易有限公司)。

1.3 菌株鑒定及藥敏分析

菌種分離劃線于血平板，長出菌落后，用MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀重新鑒定，采用紙片擴(kuò)散(K-B)法及Vitek-2 compact儀器進(jìn)行藥敏實驗,微量肉湯稀釋法測定菌株對頭孢西丁和阿米卡星的MIC值，判讀及結(jié)果解釋根據(jù)2018年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)文件進(jìn)行。

1.4 莢膜血清型及相關(guān)毒力基因檢測

通過煮沸法提取細(xì)菌基因組作為DNA模板，分別擴(kuò)增6種莢膜血清型基因及8種相關(guān)毒力基因。將

aerobactin

基因陽性的菌株定義為

hvKP

。基因類型及引物序列參考文獻(xiàn)，于表1中列出，反應(yīng)體系為25 μl，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，50～58 ℃退火90 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后于4 ℃保存。

表1 各種引物(莢膜血清型及相關(guān)毒力基因)序列

1.5 亞抑菌濃度抗生素作用下毒力相關(guān)基因表達(dá)水平檢測

挑取每株菌的單個菌落經(jīng)麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)0.5麥?zhǔn)蠞岫群螅肕H肉湯培養(yǎng)基稀釋10倍，分裝到4個EP管中，根據(jù)每株菌對2種藥的MIC值，計算抗生素用量，使3個EP管中抗生素終濃度分別達(dá)到1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，第1管不加抗生素作為對照。于37 ℃溫箱中搖菌6 h后，進(jìn)行提mRNA、逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR，以16SRNA作為內(nèi)參基因，設(shè)計適用于qRT-PCR 2對毒力基因的引物，見表2。

表2 qRT-PCR毒力基因的引物

1.6 ERIC-PCR同源性分析

引物序列：ERIC1，ATGTAAGCTCCTGGGGATTCA；ERIC2，AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共20個循環(huán)，隨后94 ℃變性1 min，42 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳(100 V、100 min，0.5×TAE)，根據(jù)參考文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。

1.7 MALDI-TOF MS同源性分析

用無菌接種環(huán)直接將新鮮細(xì)菌涂布于靶板上，取1 μl CHCA基質(zhì)液均勻覆蓋其表面，待自然晾干后上機(jī)檢測，通過對不同位置100次的激光點(diǎn)擊而獲得每一個樣品的蛋白質(zhì)譜峰，儀器可檢測的蛋白質(zhì)質(zhì)量范圍為2 000～20 000 Da，得到的蛋白質(zhì)譜峰信息經(jīng)軟件校正，然后與儀器內(nèi)的微生物數(shù)據(jù)庫圖譜進(jìn)行比對，從而得到鑒定結(jié)果。通過VITEK MS SARAMIS軟件查看分析鑒定結(jié)果，并導(dǎo)入圖譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行聚類分析，相似度<70%者為不同的質(zhì)譜型別，用Ⅰ～Ⅲ表示不同的型別。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性

57株

hvKP

除對氨芐西林天然耐藥外，對大部分臨床常用抗生素都維持在較高的敏感率，其對各類抗生素耐藥率情況見圖1。

圖1 57株高毒力肺炎克雷伯菌的耐藥率

2.2 莢膜血清型和毒力基因檢出情況

通過PCR技術(shù)檢出K1型、K2型、K20型、K57型分別為17株、21株、2株、8株，檢出率分別為29.8%、36.8%、3.5%、14%。有9株未檢出莢膜血清型，未檢出K5型、K54型莢膜血清型。檢出毒力基因

rmpA

、

aerobactin

、

alls

、

kfu

、

wcag

、

magA

、

fimH

、

mrkD

分別為57株、57株、8株、21株、17株、16株、57株、57株。陽性標(biāo)本條帶圖見圖2。

圖2 莢膜血清型和毒力基因陽性條帶圖

2.3 亞抑菌濃度抗生素下毒力基因表達(dá)情況

根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，與對照組相比，在頭孢西丁的作用下

rmpA

及

aerobactin

的表達(dá)量都受到明顯的抑制，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=14.33,

P

<0.05)；在阿米卡星作用下，與對照組相比，

rmpA

及

aerobactin

的表達(dá)同樣受到了抑制，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=12.47，

P

<0.05)。見圖3。

2.4 ERIC-PCR及MALDI-TOF MS同源性分析

ERIC-PCR將57株菌株分為19個型別，其中A、B、C型各4株，D—I型各3株，J—L型各2株，M、N型各6株、5株，O—S型菌株各1株。MALDI-TOF MS按照蛋白圖譜相似性≥70%標(biāo)準(zhǔn)將57株菌株分為3型，用Ⅰ—Ⅲ來表示，見圖4。

3 討論

KP

屬于腸桿菌科細(xì)菌家族之一，可以引起社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染，已經(jīng)成為除大腸埃希菌外，分離率最多的條件致病菌，可使免疫力低下的患者發(fā)生尿路感染、腹腔感染、血流感染、肺部感染等，尤其是

hvKP

，由于細(xì)胞壁外有一層厚厚的莢膜，可以抵抗中性粒細(xì)胞的殺傷作用，可以引起正常青年人肝膿腫并易向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，多見合并眼內(nèi)炎、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥等，已引起廣泛關(guān)注，有研究表明，與經(jīng)典型肺炎克雷伯菌(

classic

klebsiella

pneumoniae

，

cKP

)相比，

hvKP

只需要50個細(xì)菌就可引起小鼠的死亡，而

cKP

則需要10個細(xì)菌才可引起小鼠的死亡，足以說明

hvKP

的高毒力性，高致死性。到目前為止，沒有任何一種方法可以區(qū)分

hvKP

和

cKP

，多以表型呈現(xiàn)高黏液性作為高毒力的標(biāo)志，但是有研究指出某些菌落的表型不是高黏性也擁有強(qiáng)的毒力，故本研究從基因水平，以

aerobactin

基因陽性為標(biāo)志，共篩選出57株

hvKP

。通過藥敏實驗表明，57株

hvKP

對臨床大多數(shù)抗生素比較敏感，耐藥率較低，與國內(nèi)研究一致，其原因可能是因為菌株表面擁有一層厚厚的莢膜使菌株難以獲得耐藥質(zhì)粒且毒力基因和耐藥基因的不相容性導(dǎo)致其對臨床常用抗生素敏感，另外已有多篇文獻(xiàn)曾報道過KP在具有高毒力特性的同時又對臨床常用抗生素廣泛耐藥，但本研究未發(fā)現(xiàn)具有高毒力的同時又對碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株。經(jīng)過PCR技術(shù)檢測莢膜血清型和毒力基因顯示，血清型K1、K2型檢出率最多，K1、K2型是

hvKP

最常見血清型。此外，本研究還顯示K1型檢出陽性的菌株，

wcag

、

magA

基因也檢測出陽性，說明編碼K1型血清型基因和編碼

wcag

、

magA

基因位于同一質(zhì)粒上，與Yeh et al研究一致。在8個毒力基因檢出情況看，

fimH

、

mrkD

檢出率最高，在每個菌株中都能檢出這兩種基因，與Zhao et al研究一致。說明

fimH

、

mrkD

并不能成為區(qū)分

cKP

和

hvKP

的標(biāo)志，且2種基因都屬于菌毛黏附蛋白，可以介導(dǎo)菌株和機(jī)體細(xì)胞的黏附作用，增強(qiáng)菌株的毒力作用。

rmpA

基因是莢膜多糖調(diào)節(jié)基因，可以上調(diào)莢膜多糖表達(dá)量，使菌落呈現(xiàn)黏液型。鐵作為參與細(xì)胞氧化還原的一種離子，是細(xì)胞完成各種生化反應(yīng)不可或缺的物質(zhì)，

aerobactin

基因編碼一種鐵載體，菌株將鐵載體分泌到體液中競爭結(jié)合存在于血液中的鐵離子，并通過鐵載體結(jié)合蛋白攝取鐵載體，以此增強(qiáng)其毒力的表達(dá)，且表達(dá)不受溫度影響，此外，

aerobactin

基因陽性的

hvKP

可以使其毒力增強(qiáng)100倍，這也是本研究以此基因陽性作為區(qū)分

hvKP

與

cKP

的標(biāo)志基因的原因之一。

圖3 亞抑菌濃度頭孢西丁、阿米卡星作用下rmpA、aerobactin基因相對表達(dá)量

圖4 57株hvKP的MALDI-TOF MS聚類分析圖

最低抑菌濃度是指在體外環(huán)境培養(yǎng)細(xì)菌18～24 h，可以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度，低于此濃度定義為亞抑菌濃度。頭孢西丁與阿米卡星的抗菌機(jī)制雖然不同，但是本研究在對3組亞抑菌濃度(1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC)的2種抗生素與菌株作用下毒力基因mRNA水平的變化發(fā)現(xiàn)，無論是

rmpA

還是

aerobactin

基因，轉(zhuǎn)錄水平都受到不同程度的抑制，且1/2MIC時受到的抑制最強(qiáng)，其次是1/4MIC及1/8MIC。值得注意的是本研究表明有4株菌在亞抑菌濃度阿米卡星作用下，毒力基因

aerobactin

的mRNA水平并沒有受到抑制，反而增強(qiáng)，其原因可能是細(xì)菌為了適應(yīng)抗生素帶來的選擇壓力，主動調(diào)高

aerobactin

基因的表達(dá)，以分泌更多的鐵載體來競爭周圍存在的鐵離子，以此提高菌株的生存能力，不過該基因表達(dá)升高的具體的機(jī)制需要進(jìn)一步研究探索。通過對處理組之間進(jìn)行統(tǒng)計分析可以發(fā)現(xiàn)，隨著最低抑菌濃度的降低，2種毒力基因在轉(zhuǎn)錄水平都有不同程度的升高趨勢，雖然有2組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異，其原因可能是受到了標(biāo)本量小的緣故，在接下來的研究中應(yīng)該擴(kuò)大標(biāo)本量。分子生物學(xué)方法ERIC-PCR同源性分析將57株菌株分為19個型別，最多的一型有6株，其次是5株，可以說明57株

hvKP

親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，MALDI-TOF MS將菌株分為3型，Ⅰ型內(nèi)的12株同源性較好，Ⅱ型、Ⅲ型內(nèi)包含的45株菌株因質(zhì)譜圖譜相似性<70%，同源性較差，和ERIC-PCR結(jié)果相一致。因此在亞抑菌濃度頭孢西丁和阿米卡星作用下，

rmpA

和

aerobactin

基因在轉(zhuǎn)錄水平受到抑制作用具有普遍性。雖然目前對亞抑菌濃度抗生素對

hvKP

毒力影響的研究較少，但是以往就有相關(guān)學(xué)者對亞抑菌濃度對

KP

的其他方面進(jìn)行過研究。Nomura et al的研究表明，亞抑菌濃度的β內(nèi)酰胺類抗生素可以使

KP

莢膜的厚度變薄，細(xì)胞表面疏水性變大，從而增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對

KP

的吞噬作用，而亞抑菌濃度的喹諾酮類，氨基糖苷類抗生素對

KP

的影響較小。同時本研究顯示，巨噬細(xì)胞對亞抑菌濃度頭孢地嗪處理后的

KP

的吞噬作用比其對頭孢噻肟和頭孢哌酮處理后的

KP

吞噬作用更強(qiáng),頭孢哌酮及頭孢噻肟對

KP

的毒力影響也很小。Lo Bue et al研究也證實，亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星對引起尿路感染的79%致病性大腸埃希菌的菌毛蛋白有抑制作用,本研究結(jié)果與其一致。Ricci et al的研究同樣證實，亞抑菌濃度的利福昔明對奇異變形桿菌和

KP

以及檢測的所有銅綠假單胞菌脲酶的產(chǎn)生均受到了嚴(yán)重的影響，而且也抑制了銅綠假單胞菌的外毒素的產(chǎn)生。NamiKawa et al的研究表明，亞抑菌濃度的利福平對

hvKP

具有很強(qiáng)的抗黏液特性，當(dāng)用利福平培養(yǎng)細(xì)菌時，

hvKP

的多糖提取物顯示出大大降低的黏度。此外，該研究通過顯微鏡觀察表明，利福平導(dǎo)致

hvKP

細(xì)胞周圍的莢膜層厚度急劇減少，同時利福平處理降低了

rmpA

和

rmpA

調(diào)節(jié)的莢膜基因的轉(zhuǎn)錄水平，表明利福平通過抑制

rmpA

轉(zhuǎn)錄來抑制

hvKP

的黏膜黏度。這些數(shù)據(jù)表明，處在亞抑菌濃度利福平作用下的

hvKP

，其毒力基因表達(dá)受到了抑制作用，本研究的結(jié)論與之有某種程度上的相同。目前對

hvKP

處于亞抑菌濃度抗生素的環(huán)境中毒力表達(dá)變化的研究甚少，本研究得出的結(jié)論可以豐富目前對

hvKP

的認(rèn)識，為臨床醫(yī)師合理應(yīng)用抗生素、治療由

hvKP

引起的感染提供依據(jù)。