LncRNA SNHG9敲除對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖影響及其作用機(jī)制的生物信息學(xué)探討

葉靜靜，陳天兵

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是最常見和惡性程度最高的顱內(nèi)腫瘤，具有病程短、進(jìn)展快、預(yù)后差、死亡率高的特點(diǎn)。目前傳統(tǒng)治療方法，如放化療等并沒有明顯改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。長鏈非編碼RNA( long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度超過200核苷酸但不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種與腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)的生物學(xué)過程。SNHG9是一個(gè)在腫瘤組織中具有較高表達(dá)豐度的lncRNA，然而其在腫瘤中的功能卻較少報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)旨在利用高效率和操作流程簡單的基因編輯方法CRISPR/Cas9來構(gòu)建 SNHG9基因敲除的膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞株，觀察SNHG9敲除對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響，并通過生物信息學(xué)分析探討SNHG9可能參與的生物學(xué)過程，為進(jìn)一步深入研究SNHG9的功能和分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。px330-EGFP載體源自px330-mCherry(美國Addgene公司, 貨號(hào)：98750)，由本實(shí)驗(yàn)室改造而得(通過Not I位點(diǎn)將mCherry表達(dá)模塊替換成EGFP表達(dá)模塊)。南美胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶及DMEM 高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司； BbsI、Buffer 2購自美國NEB公司； T4、感受態(tài)細(xì)胞購自日本Takara公司；基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega公司；6/24/96孔板、Yeast extract、Tryptone、瓊脂糖和瓊脂粉等購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RTCA實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀(型號(hào)為xCELLigence RTCA DP)購自艾森生物(杭州)有限公司；倒置熒光顯微鏡(型號(hào)：尼康Ti-U型)購自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1

靶點(diǎn)和檢測引物設(shè)計(jì) 從Ensembl上下載SNHG9所在位置上的基因組序列(含內(nèi)含子、外顯子、不同轉(zhuǎn)錄本序列信息)，分別截取基因上游和下游約800 bp序列用作靶點(diǎn)和檢測引物的設(shè)計(jì)。綜合不同在線設(shè)計(jì)工具給出的靶點(diǎn)序列和得分，選取在多個(gè)工具中都出現(xiàn)的且排名都靠前的序列作為最終使用的靶點(diǎn)。用到的在線工具包括E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/index.html, CRISPOR(http://crispor.tefor.net/crispor.py)，ZiFiT (http://zifit.partners.org/ZiFiT/ )。檢測引物的位置分別設(shè)計(jì)在上、下游靶點(diǎn)的外側(cè)，以及SNHG9基因的內(nèi)部，利用Primer5給出的引物序列的得分，選取得分較高的用作敲除后的基因型檢測。

1.2.2

px330-EGFP-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建 靶點(diǎn)序列引物(濃度20 μmol/L)按比例(5 μl F +5 μl R +10 μl Buffer2 +80 μl HO)加入到1.5毫升EP管中，放置于沸水中自然冷卻，形成短的含黏性未端的雙鏈DNA片段(連接片斷)；px330-EGFP經(jīng)BbsI酶切后過膠回收吸附柱，用無菌水洗脫回收(連接載體)；連接體系(1 μl連接片斷+1 μl連接載體+1 μl T4連接酶+1 μl T4 Buffer+7 μl HO)；22 ℃連接1 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂氨芐霉素抗性LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取菌落，搖菌，抽提質(zhì)粒后送樣測序鑒定。

1.2.3

SNHG9基因敲除克隆的建立 癌癥細(xì)胞系百科全書(https://portals.broadinstitute.org/ccle)上分析顯示SNHG9在U251細(xì)胞中無基因拷貝數(shù)變異，表明其為正常的二倍性。U251細(xì)胞鋪種在6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將上述構(gòu)建成功的含上、下游靶點(diǎn)序列的兩質(zhì)粒等量混合，按體系 (4 μl Lipo2000 +2.5 μg質(zhì)粒 +125 μl opti-DMEM )進(jìn)行轉(zhuǎn)染，次日更換DMEM，并用熒光顯微鏡觀察EGFP的熒光信號(hào)；轉(zhuǎn)染36 h后胰酶消化制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行流式單細(xì)胞分選；分選到96孔板中的克隆經(jīng)過2～3周的培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移并備份到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；分別提取克隆細(xì)胞株的基因組DNA，利用檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取10 μl PCR產(chǎn)物跑凝膠電泳進(jìn)行檢測，從擴(kuò)增片斷的帶型上判斷克隆細(xì)胞珠的基因型(正常型、雜合型和純合敲除型)，PCR產(chǎn)物直接測序或連TA克隆后測序獲得敲除后的具體序列。

1.2.4

細(xì)胞增殖檢測 實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)(RTCA法)：體外大量培養(yǎng)SNHG9敲除成功的U251細(xì)胞，選擇對數(shù)生長期的敲除成功的膠質(zhì)瘤U251-m3單克隆細(xì)胞和正常的U251細(xì)胞，消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后將獲得的細(xì)胞稀釋至4×10個(gè)/ml細(xì)胞懸液，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在RTCA的16孔板中的每個(gè)孔中加入50 μl DMEM培養(yǎng)基，再在每個(gè)孔中加入100 μl的細(xì)胞懸浮液。連續(xù)觀察200 h，通過儀器來檢測細(xì)胞的增殖能力。

1.2.5

生物信息學(xué)分析工具 利用GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)分析SNHG9表達(dá)情況；GEPIA2和UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)共同用于相似表達(dá)基因的提取； FunRich (http://www.funrich.org/) 用于韋恩圖的繪制和信號(hào)通路的富集分析。每一種工具在網(wǎng)絡(luò)上都有對應(yīng)的教程指導(dǎo)使用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果用表示，RTCA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用雙因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較采用Tukey HSD檢驗(yàn)。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)和檢測引物設(shè)計(jì)

利用在線工具在SNHG9基因的上、下游各設(shè)計(jì)1個(gè)靶點(diǎn)，從分析得到的序列中篩選得分高的作為靶點(diǎn)(T1、T2)，并在5′端添加相應(yīng)的黏性末端序列用作與px330-EGFP載體相連(圖1)，在設(shè)計(jì)好的兩靶點(diǎn)(T1、T2)的外側(cè)和內(nèi)部各設(shè)計(jì)1對引物(FO/RO和FI/RI)用作敲除細(xì)胞的基因型檢測(表1)。

表1 靶點(diǎn)序列和檢測引物序列列表

圖1 SNHG9基因結(jié)構(gòu)

2.2 px330-EGFP-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

反向互補(bǔ)的靶點(diǎn)引物對(指導(dǎo)sgRNA合成)退火后與經(jīng)BbsI酶切回收的px330載體相連，產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂平板、克隆搖菌后進(jìn)行質(zhì)粒提取和送樣測序。測序結(jié)果顯示質(zhì)粒px330-EGFP-sgRNA-T1和px330-EGFP-sgRNA-T2構(gòu)建成功(圖2)。

2.3 SNHG9敲除克隆細(xì)胞株的建立

將px330-EGFP-sgRNA-T1和px330-EGFP-sgRNA-T2共轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后12 h即可見EGFP表達(dá)，通過在軟件上圈選，可將強(qiáng)熒光表達(dá)的細(xì)胞通過MoFlo_XDP分選到96孔板中， 分選后的細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。本研究共成功培養(yǎng)出8個(gè)克隆細(xì)胞株，利用檢測引物FO RO進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)跑膠條帶大小分析顯示3號(hào)克隆僅含有敲除條帶(純合敲除型，約600 bp)，4號(hào)克隆既含有敲除條帶又含有正常條帶(雜合型)，其他克隆均只有正常條帶(正常型，約1 421 bp)(圖3A)。進(jìn)一步用檢測引物FI/RI進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示3號(hào)克隆擴(kuò)增不出正常大小的片斷(圖3A)。對3號(hào)克隆(U251-m3)的PCR片斷進(jìn)行測序，結(jié)果顯示該片斷為單一序列組成的成功敲除后的重組片斷，中間刪除了一個(gè)包含SNHG9基因的756 bp的片斷(圖3B)。

2.4 SNHG9敲除對細(xì)胞形態(tài)的影響

對建立的敲除細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。如圖4所示，普通U251細(xì)胞形態(tài)一致性較高，而U251-m3則表現(xiàn)出一定的形態(tài)異質(zhì)性，部分細(xì)胞的胞體變得扁平寬大。

圖2 px330-EGFP-sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建A: px330-EGFP載體結(jié)構(gòu)示意圖；B: px330-EGFP-sgRNA質(zhì)粒測序峰圖；紅色框：靶點(diǎn)序列

圖3 敲除克隆細(xì)胞株的鑒定

圖4 敲除克隆細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)觀察 ×200A：U251；B：U251-m3

2.5 SNHG9敲除對U251細(xì)胞增殖的影響

RTCA實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀顯示不同時(shí)間點(diǎn)下敲除成功的U251-m3細(xì)胞和對照組U251細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)的統(tǒng)計(jì)描述指標(biāo)如表2所示，敲除成功的U251-m3增殖的細(xì)胞指數(shù)與對照組U251細(xì)胞比較,增殖速度顯著降低。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)的對照組U251細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組U251-m3細(xì)胞增殖的統(tǒng)計(jì)數(shù)值的大小及增殖抑制率

圖5 RTCA法檢測SNHG9基因敲除對U251細(xì)胞增殖的影響與對照組U251細(xì)胞比較：*P<0.05

2.6 SNHG9的表達(dá)分析，共表達(dá)基因查找及富集分析

GEPIA2在線分析顯示SNHG9在GBM腫瘤組織中的表達(dá)相比在正常組織(N)中的表達(dá)明顯升高(圖6A)。從GEPIA2中提取到1 000個(gè)在GBM腫瘤中與SNHG9表達(dá)相似的基因(表達(dá)相關(guān)性系數(shù)R大于0.3)，從UALCAN中提取到568個(gè)表達(dá)相關(guān)性系數(shù)大于0.3的基因，兩者的交集為474個(gè)基因(圖6B)。將這474個(gè)基因進(jìn)行FunRich信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示這些基因顯著地富集在與線粒體功能相關(guān)的條目下，包括呼吸電子傳遞鏈、ATP合成、TCA循環(huán)等(圖6C)。

圖6 SNHG9的生物信息學(xué)分析

3 討論

CRISPR/Cas系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)于原核生物中，與獲得性免疫相關(guān)，能使宿主細(xì)胞獲得抵抗噬菌體、質(zhì)粒等外來DNA入侵的能力。自2012年開始，CRISPR/Cas 系統(tǒng)逐漸被廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因組DNA編輯，并得到了深入地發(fā)展，衍生出包括敲除、敲入、轉(zhuǎn)錄抑制或激活、RNA水平編輯、組學(xué)水平篩選等多種新的技術(shù)手段；相比以往的基因編輯手段，由于其操作簡便，快速省時(shí)、編輯效率高等優(yōu)點(diǎn)推進(jìn)了生命科學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究方法的革新，并促成了許多新的治療手段的開發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化，如在糾正某些遺傳病的基因突變和癌癥病人的免疫細(xì)胞治療中的應(yīng)用等。

以siRNA、shRNA來進(jìn)行的腫瘤基因功能研究，實(shí)驗(yàn)操作、試劑以及敲降效率等對最終的結(jié)果都有很大的影響，經(jīng)常需要多次重復(fù)才能得到較為肯定的結(jié)論。相比之下，CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除可實(shí)現(xiàn)對目的基因產(chǎn)物的完全消除，敲除結(jié)局穩(wěn)定遺傳，避免了許多干擾因素，具有獨(dú)特的方法學(xué)上的優(yōu)勢。本研究通過結(jié)合流式單克隆分選，成功建立一株SNHG9敲除的U251細(xì)胞株(U251-m3)。相比于通過有限稀釋法獲得單克隆，單細(xì)胞分選操作省時(shí)、高效且精準(zhǔn)。盡管PCR從U251-m3擴(kuò)增出的敲除片斷的測序結(jié)果為單一序列組成， 但兩對檢測引物從U251-m3中都未擴(kuò)增出正常大小的基因片斷，表明SNHG9已被完全敲除。造成單一序列組成的原因有兩種：一是兩等位基因上發(fā)生了敲除后的重組序列完全一致的現(xiàn)象；另一種可能是上、下游兩靶點(diǎn)在雙鏈斷裂修復(fù)的過程中丟失了斷點(diǎn)處部分片斷，而當(dāng)丟失的這部分片斷包含引物序列時(shí)就無法被正常擴(kuò)增。

LncRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，近年來已成為腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究、標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)挖掘的又一熱點(diǎn)。本研究顯示SNHG9在GBM組織中相比正常組織表達(dá)水平顯著升高，SNHG9敲除后細(xì)胞形態(tài)上有一定程度的改變，SNHG9敲除的U251-m3細(xì)胞株相比正常的U251細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制，這些結(jié)果表明SNHG9在GBM中是一個(gè)促癌基因。在細(xì)胞的生物學(xué)過程中，功能相關(guān)的基因通常受控于相同的調(diào)控機(jī)制，因此具有共同的表達(dá)模式；該研究通過兩個(gè)常用的在線工具提取了SNHG9在GBM中的共表達(dá)基因，共表達(dá)基因的富集分析結(jié)果提示SNHG9可能與線粒體的相關(guān)功能有關(guān)；能量代謝重編程是癌或癌細(xì)胞的十大特征之一，Warburg效應(yīng)(有氧糖酵解)與線粒體的功能直接相關(guān)；這些結(jié)果顯示SNHG9有可能是通過影響線粒體功能進(jìn)而調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)形為的。最近一篇研究顯示干擾SNHG9的表達(dá)確實(shí)可調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和有氧糖酵解，該研究分析的結(jié)果與之一致，但其采用的是敲降的手段，對SNHG9的表達(dá)干擾不完全，并且未有很深入的機(jī)制上的研究。然而又有研究提示SNHG9在胰腺癌中扮演著抑癌基因的角色，表明SNHG9在腫瘤中的功能和角色具有類型特異性。