海馬CRHR1受體介導(dǎo)妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄性小鼠抑郁

張 闊，陳 鵬，錢志侃，陶 龍，姚余有，3

抑郁癥是一種常見的、令人虛弱的潛在致命精神疾病。抑郁癥患者核心癥狀為情緒低落、思維遲緩、意志活動(dòng)減退，還可能出現(xiàn)睡眠障礙、反復(fù)自殺念頭等。抑郁癥的發(fā)病原因尚未完全闡明，眾多研究顯示，前額葉皮層、海馬、杏仁核和下丘腦等部位異常與抑郁的發(fā)病有關(guān)。課題組的前期研究顯示妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠抑郁，側(cè)腦室注射促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1(corticotropin-releasing hormone receptor1，CRHR1)拮抗劑可改善妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠抑郁程度。由于CRHR1廣泛分布于大腦皮層、海馬、杏仁核和下丘腦等多個(gè)腦區(qū)域，為了確定海馬CRHR1是否介導(dǎo)妊娠期慢性應(yīng)激致子代抑郁，該研究通過與江蘇賽業(yè)公司共同建立了海馬CRHR1基因條件性敲除鼠模型，利用海馬CRHR1基因條件性敲除鼠進(jìn)一步研究海馬CRHR1是否介導(dǎo)妊娠期慢性應(yīng)激致子鼠抑郁及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從江蘇賽業(yè)生物公司引進(jìn)2只雌性mCrhr1 CK877-tsd-2D12 flox/+小鼠和2只雄性mCrhr1 CK877-tsd-2D12 flox/+小鼠以及一對(duì)特異性在小鼠海馬CRHR1基因中表達(dá)CRE重組酶的Pomc-cre小鼠。小鼠品系為C57BL/6。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物引入安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)P2級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，在室溫(24±1)℃和 50%的相對(duì)濕度下飼養(yǎng)，隔離觀察1周未發(fā)現(xiàn)異常后轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)區(qū)，嚴(yán)格按照SPF級(jí)動(dòng)物管理規(guī)定進(jìn)行飼養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1

主要儀器 垂直電泳儀、轉(zhuǎn)移槽、凝膠成像系統(tǒng)(北京Tanon公司)；ELX全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BD公司)；Centrifuge5424R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；強(qiáng)迫游泳圖像采集及分析系統(tǒng)(上海欣軟公司)；正置熒光顯微鏡(德國(guó)徠卡儀器有限公司)；擴(kuò)增儀(美國(guó)ThermoFisher公司)；DNA電泳槽(上海天能科技有限公司)。

1.2.2

主要試劑 mTOR單克隆抗體、p-mTOR(Ser2448)單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；山羊抗兔IgG抗體(中杉金橋公司)；總蛋白BCA測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物有限公司)；β-actin單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；TUNEL試劑盒(上海羅氏制藥有限公司)；DNA引物(英濰捷基上海貿(mào)易有限公司)；小鼠CRHELISA酶聯(lián)免疫試劑盒(上海江萊生物有限公司)。

1.3 海馬CRHR1基因特異性敲除小鼠的繁育方案及分組

小鼠的繁育方案如下：♂/♀flox雜合子小鼠(flox/+)與♀/♂flox雜合子小鼠(flox/+)交配后獲得flox純合子小鼠(flox/flox)；同時(shí)♂/♀(flox/+)小鼠與♀/♂Pomc-cre小鼠交配后獲得CRHR1基因條件性敲除雜合子小鼠(flox/+，with

cre

)；最后♀(flox/flox)小鼠與♂(flox/+，with

cre

)小鼠交配可產(chǎn)生(flox/flox，with

cre

)小鼠(CRHR1基因敲除純合子，CKOA組)、(flox/+，with

cre

)小鼠(CRHR1基因敲除雜合子，CKOH組)以及(flox/flox，no

cre

)小鼠(CRHR1基因表達(dá)正常)和(flox/+，no

cre

)小鼠(CRHR1基因表達(dá)正常)。小鼠鑒定方法為酚氯仿法提取DNA測(cè)定子代小鼠基因型。實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取30只8周齡(flox/flox)小鼠雌鼠(CRHR1基因正常表達(dá))與15只8周齡(flox/+，with

cre

)小鼠雄鼠(CRHR1基因條件性敲除)在20：00以雌雄2:1合籠，第2天07：00查陰栓，檢查到陰栓的將其分出單籠喂養(yǎng)，記為懷孕的第1天。常規(guī)飼養(yǎng)1周后選擇15只孕鼠進(jìn)行慢性不可預(yù)測(cè)性溫和應(yīng)激(the chronic unpredictable mild stress，CUMS)。應(yīng)激方式包括：①夜間照明12 h；②禁水24 h；③溫水游泳5 min；④束縛應(yīng)激2 h；⑤禁食24 h；⑥夾緊尾巴5 min；⑦冷水游泳5 min；⑧籠傾斜45°角24 h。自孕第7天開始，每天使用抽簽法隨機(jī)選擇1種應(yīng)激方式(如與前1天相同，重新抽簽)直至孕鼠分娩，這種應(yīng)激方式可以引起孕鼠HPA軸激活，避免孕鼠產(chǎn)生應(yīng)激耐受性。子鼠出生后依據(jù)其基因型選取雄性子鼠(酚氯仿法提取DNA測(cè)定子代小鼠基因型)，分為妊娠期正常對(duì)照+子代基因正常組(CON組)、妊娠期正常對(duì)照+子代CRHR1基因敲除雜合子組(CON+CKOH)、妊娠期正常對(duì)照+子代CRHR1基因敲除純合子組(CON+CKOA)、妊娠期慢性應(yīng)激+子代基因正常組(CUMS組)、妊娠期慢性應(yīng)激+子代CRHR1基因敲除雜合子組(CUMS+CKOH)、妊娠期慢性應(yīng)激+子代CRHR1基因敲除純合子組(CUMS+CKOA),每組

n

=10。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1

強(qiáng)迫游泳測(cè)試(forced swimming test，F(xiàn)ST) 實(shí)驗(yàn)第1天，將每組中的10只小鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，將小鼠置于直徑20 cm玻璃桶中游泳15 min(水深30 cm，水溫24 ℃左右)。第2天，將小鼠置于桶中游泳6 min，拍攝小鼠在桶中的運(yùn)動(dòng)情況，統(tǒng)計(jì)后4 min不動(dòng)時(shí)間總和。

1.4.2

懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test，TST) 實(shí)驗(yàn)時(shí)，從每組中隨機(jī)選出10只小鼠，用夾子(夾子中塞棉花)夾住小鼠尾部距尾尖2 cm處，隨后將其懸掛在實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，錄像機(jī)記錄其6 min中內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，統(tǒng)計(jì)6分鐘內(nèi)后4 min的不動(dòng)時(shí)間總和。

1.4.3

糖水偏好實(shí)驗(yàn)(sucrose preference test，SPT) 實(shí)驗(yàn)第1天，從每組中隨機(jī)選出10只小鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，在每個(gè)籠子兩側(cè)放2瓶1%蔗糖水(50 ml的透明玻璃瓶)。第2天，禁食、禁水1 d。第3天，每個(gè)籠子一側(cè)放1瓶1%蔗糖水，另外一側(cè)放1瓶純凈水。稱重并記錄1%蔗糖水和純凈水消耗量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分析得到數(shù)據(jù)并且計(jì)算糖水偏好值=(糖水前后重量差值/總液體前后重量差值)×100%。

1.5 Western blot法測(cè)海馬組織mTOR和p-mTOR(Ser2448)蛋白含量

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取4只鼠，冰上取腦，分離出海馬組織，根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒的操作說明測(cè)定海馬總蛋白濃度。根據(jù)測(cè)出的蛋白總量確定上樣量，8%SDS-PAGE用于分離樣品，然后經(jīng)過上樣，電泳(120 V，180 min)，轉(zhuǎn)膜(250 mA，4 h)，封閉(5%脫脂奶粉)，一抗(兔單抗，1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗膜，二抗(羊抗兔，1∶2 000)孵育，TBST洗過后加入顯影液進(jìn)行ECL顯色，測(cè)其吸光度值分析結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參。

1.6 TUNEL法測(cè)海馬CA3區(qū)椎體神經(jīng)元的凋亡指數(shù)

將海馬組織用石蠟包埋，切片后得到石蠟切片，然后經(jīng)脫蠟水化，3%過氧化氫甲醇浸洗10 min，滴加蛋白酶K(20 μg/ml)工作液，37 ℃ 15 min，PBS清洗后滴加新鮮配置的TUNEL反應(yīng)混合物，37 ℃避光孵育60 min，PBS清洗后滴加DAPI細(xì)胞染色液復(fù)染，避光孵育10 min，在熒光顯微鏡下(×200)觀察。統(tǒng)計(jì)TUNEL染色陽(yáng)性的細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算兩者比值即為AI。

2 結(jié)果

2.1 CRHR1條件性敲除對(duì)妊娠期慢性應(yīng)激的子代雄鼠行為學(xué)影響

強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CON組、CON+CKOH組和CON+CKOA組的小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CON組相比，CUMS組、CON+CKOH組和CON+CKOA組小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間均較長(zhǎng)(

P

<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+CKOA組小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間減少(

P

<0.05)；與CUMS+CKOH組相比，CUMS+CKOA組不動(dòng)時(shí)間也減少(

P

<0.05)。但CUMS組和CUMS+CKOH組間小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、2。

圖1 妊娠期慢性應(yīng)激對(duì)不同組別小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響

圖2 妊娠期慢性應(yīng)激對(duì)不同組別小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響

糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。CON組、CON+CKOH組和CON+CKOA組小鼠糖水偏好率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CON組相比，CUMS組小鼠糖水偏好率降低(

P

<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+CKOH組和CUMS+CKOA組糖水偏好率上升(

P

<0.05)。此外，CUMS+CKOH組與CUMS+CKOA組間小鼠糖水偏好率差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。

圖3 妊娠期慢性應(yīng)激對(duì)不同組別子鼠糖水偏好率的影響

2.2 CRHR1條件性敲除對(duì)妊娠期慢性應(yīng)激的子代雄鼠海馬錐體神經(jīng)元凋亡的影響

在正置熒光顯微鏡(×200)下觀察每張切片，選取小鼠海馬CA3區(qū)4個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，DAPI染色的細(xì)胞核呈藍(lán)色，TUNEL染色的細(xì)胞核呈綠色，統(tǒng)計(jì)TUNEL染色陽(yáng)性的細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算AI。TUNEL染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。與CON組相比，CUMS組小鼠TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，凋亡指數(shù)升高(

P

<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+CKOA組小鼠TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少，凋亡指數(shù)降低(

P

<0.05)。但CUMS組和CUMS+CKOH組間凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 CRHR1條件性敲除對(duì)妊娠期慢性應(yīng)激的子代海馬mTOR、p-mTOR(Ser2448)蛋白表達(dá)影響

采用Western blot方法檢測(cè)海馬腦組織中mTOR和p-mTOR蛋白含量，結(jié)果如圖5和圖6所示。CON組、CON+CKOH組和CON+CKOA組小鼠海馬mTOR和p-mTOR表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CON組相比，CUMS組、CUMS+CKOH組和CUMS+CKOA組小鼠海馬mTOR和p-mTOR表達(dá)量均較低(

P

<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+CKOA組小鼠海馬mTOR和p-mTOR表達(dá)量升高(

P

<0.05)，但CUMS+CKOH組與CUMS組相比小鼠海馬mTOR和p-mTOR表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 不同組海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元凋亡的

圖5 不同組子鼠海馬mTOR蛋白水平

3 討論

海馬是抑郁癥研究中最常研究的大腦區(qū)域之一。研究表明，抑郁癥發(fā)病機(jī)理可能與海馬體積縮小，海馬神經(jīng)元的減少、可塑性降低等有關(guān)。以往的研究顯示，CRH可經(jīng)CRHR1致海馬神經(jīng)元樹突棘損傷，本課題組的前期研究顯示側(cè)腦室注射CRHR1拮抗劑可改善妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠抑郁，但由于CRHR1廣泛分布在皮層，海馬和杏仁核和下丘腦等部位，故以往結(jié)果不能確定是哪個(gè)組織的CRHR1介導(dǎo)了妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠抑郁，因此，本文利用海馬CRHR1基因條件性敲除鼠，進(jìn)一步研究海馬CRHR1是否介導(dǎo)妊娠期慢性應(yīng)激致子鼠抑郁及機(jī)制。

圖6 不同組子鼠海馬p-mTOR蛋白水平

該研究采用慢性不可預(yù)測(cè)性溫和應(yīng)激進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，目的是避免孕鼠對(duì)單一應(yīng)激產(chǎn)生了適應(yīng)性。FST和TST是基于絕望的行為學(xué)檢測(cè)方法，SPT是基于獎(jiǎng)賞的行為學(xué)檢測(cè)方法，均是反映抑郁模型抑郁程度的指標(biāo)。在FST和TST實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)，表明小鼠抑郁程度越重；在SPT實(shí)驗(yàn)中糖水偏好率越低也表示小鼠抑郁程度越重。海馬CRHR1基因條件性敲除鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在FST和TST實(shí)驗(yàn)中，與CON組相比，CUMS組、CUMS+CKOH組和CUMS+CKOA組不動(dòng)時(shí)間均增長(zhǎng)，而與CUMS組相比，CUMS+CKOA組的不動(dòng)時(shí)間減少；在SPT實(shí)驗(yàn)中，與CON組相比，CUMS組、CUMS+CKOH組和CUMS+CKOA組糖水偏好率均下降，而與CUMS組相比，CUMS+CKOH組和CUMS+CKOA組的糖水偏好率上升。這些結(jié)果表明，海馬CRHR1的全缺失或半缺失會(huì)降低妊娠期慢性應(yīng)激所引起的子代的抑郁程度，說明海馬CRHR1參與了妊娠期慢性應(yīng)激致子代抑郁。

以往研究顯示海馬CA3區(qū)與抑郁樣行為存在密切關(guān)系，本研究TUNEL試驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON組相比，CUMS組、CUMS+CKOH組和CUMS+CKOA組海馬CA3區(qū)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均增多，凋亡指數(shù)增高(

P

<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+CKOA組凋亡指數(shù)下降(

P

<0.05)，提示妊娠期慢性應(yīng)激可能經(jīng)海馬CRHR1引起海馬神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致子代抑郁。

mTOR是一種普遍表達(dá)的絲氨酸-蘇氨酸激酶，它感知并整合了多種細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境線索，以協(xié)調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝等主要過程。研究發(fā)現(xiàn)，激活mTOR通路，可通過上調(diào)多種相關(guān)蛋白的磷酸化水平，提高神經(jīng)元的可塑性，產(chǎn)生抗抑郁效果。本次研究結(jié)果顯示，與CON組相比，CUMS組海馬mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著下降；與CUMS組相比，CUMS+CKOA組小鼠海馬mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著增加，這說明海馬CRHR1的敲除可以上調(diào)妊娠期慢性應(yīng)激引起的下降的mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)水平，mTOR通路被激活，海馬神經(jīng)元凋亡程度下降。

該研究表明海馬CRHR1基因敲除可以改善妊娠期慢性應(yīng)激引起的異常的子代雄鼠的行為學(xué)、病理以及mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)，但未能使子代的上述指標(biāo)恢復(fù)至正常子鼠水平，這提示除海馬外，可能還有其他相關(guān)的腦部區(qū)域發(fā)揮著重要作用，杏仁核和前額皮層的CRHR1受體是否也參與妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠抑郁，有待進(jìn)一步研究。