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    丹參酮Ⅱa通過AMPK/mTOR通路調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)急性白血病細(xì)胞凋亡作用機(jī)制研究*

    2021-04-08 03:36:38潘一鳴李蕊白黃子明陳信義
    中國中醫(yī)急癥 2021年3期

    潘一鳴 李蕊白 黃子明 王 婧 馬 薇 陳信義 侯 麗

    (北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700)

    急性髓系白血?。ˋML)是起源于造血干祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病,占成人急性白血病的80%,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、出血、貧血和白血病細(xì)胞浸潤,起病較急,自然病程僅3個月左右[1]。雖然化療、支持治療和造血干細(xì)胞移植(HSCT)的進(jìn)步改善了AML的預(yù)后,但60歲以下成人AML的5年生存率仍只有30%~40%,高齡患者更低[2]。尋找新的治療方法和藥物意義重大。丹參是治療AML的常用中藥,其主要有效成分丹參酮Ⅱa具有良好的抗腫瘤活性,但丹參酮Ⅱa在AML中的作用和機(jī)制研究尚不充分,本研究通過AML細(xì)胞HL-60探究丹參酮Ⅱa體外抗白血病的效應(yīng)和作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試藥與儀器 丹參酮Ⅱa(貨號HY-N0135,批號28232)、巴弗洛霉素A1(貨號HY-100558,批號81280)由MedChemExpress公司生產(chǎn)。IMDM培養(yǎng)基(貨號12440061)、青鏈霉素(貨號15140122)、胎牛血清(貨號10099141)由Gibco公司生產(chǎn)。CCK-8細(xì)胞增殖-毒性試劑盒(Cell Counting Kit-8,貨號CK04)由日本同仁公司生產(chǎn)。吉姆薩染液(貨號G1015)為Solarbio公司生產(chǎn)。一抗Caspase-3(貨號ab32351)、PARP-1(貨號ab191217)、LC3B(貨號 ab192890)、p-AMPK(貨號ab194920)、p-mTOR(貨號 ab109268)、β-actin(貨號ab8226)抗體由Abcam公司生產(chǎn)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(貨號A0208、A0216)由碧云天公司生產(chǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號FormaTMSeries 3 Water Jacketed CO2Incubator)為Thermo公司產(chǎn)品。細(xì)胞光學(xué)顯微鏡(型號DM750)為萊卡公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀(型號SpectraMax M5)為BioTek Instrments公司產(chǎn)品。蛋白電泳儀(型號Mini-PROTEAN Tetra)為伯樂公司產(chǎn)品。

    1.2 細(xì)胞 急性髓系白血病細(xì)胞HL-60由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫所提供,以含20%胎牛血清、1%青鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng),2~3 d換液。

    1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力及增殖抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞,設(shè) 0(對照組)、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L丹參酮Ⅱa組,按1×104個/孔接種于96孔板后加藥處理24 h和48 h,并另設(shè)僅含培養(yǎng)基的空白組。處理完畢后加入CCK-8各10 μL培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后,用酶標(biāo)儀測450 nm處吸光度值(OD),計(jì)算增殖抑制率和細(xì)胞存活率。將增殖抑制率數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 7.00行非線性回歸擬合獲得IC50。結(jié)合24 h組IC50結(jié)果,設(shè)丹參酮Ⅱa 0 μmol/L+巴弗洛霉素A1 0 nmol/L組,巴弗洛霉素A1 20 nmol/L組,丹參酮Ⅱa 32 μmol/L組,丹參酮Ⅱa 32μmol/L+巴弗洛霉素A1 20 nmol/L組,予相應(yīng)處理24 h后CCK-8法測細(xì)胞存活率。

    1.4 吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài) 丹參酮Ⅱa處理HL-60細(xì)胞24 h后,制成細(xì)胞涂片,甲醇固定,吉姆薩染片15 min后自來水沖洗,晾干,光學(xué)顯微鏡下觀察。

    1.5 Western blotting檢測凋亡與自噬相關(guān)因子水平細(xì)胞經(jīng)處理后以1×磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次,冰上裂解細(xì)胞,提取總蛋白,制樣,行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉3 h,裁膜,一抗4℃過夜,二抗孵育1 h,曝光。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,計(jì)量資料以(±s)表示。經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)后,正態(tài)數(shù)據(jù)間比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組HL-60增殖抑制率比較 隨著丹參酮Ⅱ濃度升高,抑制HL-60作用增強(qiáng),48 h效果強(qiáng)于24 h,見表1。行非線性回歸擬合,得24、48 h丹參酮Ⅱ的IC50分別為 32.87、18.4 μmol/L,見表 1。分別取 0、16、32、64 μmol/L行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    表1 丹參酮Ⅱa對HL-60增殖抑制率影響(%,±s)

    表1 丹參酮Ⅱa對HL-60增殖抑制率影響(%,±s)

    丹參酮Ⅱa(μmol/L)24 h 48 h 1 2 4 8 16 32 64 128 4.38±2.14 6.47±1.81 8.29±3.54 16.30±3.78 32.57±8.07 48.87±3.77 68.20±3.05 80.37±2.16 9.14±1.69 13.63±4.25 19.84±2.20 29.45±3.04 41.02±4.72 62.68±2.64 79.13±1.92 93.42±1.17

    2.2 不同濃度丹參酮Ⅱa對HL-60細(xì)胞形態(tài)的影響光鏡下觀察HL-60細(xì)胞,丹參酮Ⅱa 0μmol/L組細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞核大小均一;16 μmol/L組細(xì)胞核縮小,形態(tài)不均一,可見核固縮深染、含凋亡小體的凋亡細(xì)胞;32 μmol/L組凋亡細(xì)胞顯著增加;64μmol/L組鏡下見大量凋亡細(xì)胞和破碎細(xì)胞。見圖1。

    圖1 不同濃度丹參酮Ⅱa對HL-60細(xì)胞形態(tài)影響(吉姆薩染色,400倍)

    2.3 不同濃度丹參酮Ⅱa對HL-60凋亡因子水平的影響 隨著丹參酮Ⅱa濃度的升高,Caspase-3減少,Cleaved-Caspase-3增多,PARP-1切割增多,見圖2。行定量分析得各組與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。表明丹參酮Ⅱa以濃度依賴的方式誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。

    圖2 不同濃度丹參酮Ⅱa對HL-60凋亡因子水平的影響

    表2 不同濃度丹參酮Ⅱa對HL-60凋亡因子影響的相對灰度值定量分析(±s)

    表2 不同濃度丹參酮Ⅱa對HL-60凋亡因子影響的相對灰度值定量分析(±s)

    注:與0 μmol/L比較,*P<0.05。下同。

    凋亡因子Caspase-3 Cleaved-Caspase-3 Cleaved-PARP-1 n 3 3 3 0 μmol/L 1.03±0.08 0.23±0.02 0.35±0.05 16 μmol/L 0.83±0.05*0.29±0.02*0.59±0.06*32 μmol/L 0.64±0.01*0.38±0.02*0.76±0.03*64 μmol/L 0.53±0.06*0.78±0.03*0.92±0.05*

    2.4 不同濃度丹參酮Ⅱa對HL-60自噬因子水平的影響 隨著丹參酮Ⅱa濃度上升,p-AMPK、LC3B水平上升,p-mTOR水平下降,表明AMPK/mTOR通路和自噬被激活,見圖3。定量分析得各組較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。表明丹參酮Ⅱa以濃度依賴的方式激活A(yù)MPK/mTOR通路,誘導(dǎo)HL-60自噬。

    表3 不同濃度丹參酮Ⅱa對HL-60自噬因子影響的相對灰度值定量分析(±s)

    表3 不同濃度丹參酮Ⅱa對HL-60自噬因子影響的相對灰度值定量分析(±s)

    凋亡因子p-AMPK p-mTOR LC3B n 3 3 3 0 μmol/L 0.13±0.02 1.03±0.06 0.12±0.02 16 μmol/L 0.52±0.02*0.49±0.02*0.41±0.03*32 μmol/L 0.78±0.03*0.40±0.02*0.65±0.03*64 μmol/L 1.10±0.01*0.23±0.04*1.08±0.07*

    圖3 不同濃度丹參酮Ⅱa對HL-60自噬因子表達(dá)量的影響

    2.5 不同濃度丹參酮Ⅱa和巴弗洛霉素A1對HL-60細(xì)胞存活率的影響 丹參酮Ⅱa 32 μmol/L組存活率降至(51.21±2.36)%,與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與巴弗洛霉素A1聯(lián)用后存活率恢復(fù)至(76.82±3.05)%,與丹參酮Ⅱa 32μmol/L組對比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。丹參酮Ⅱa誘導(dǎo)HL-60凋亡的作用被巴弗洛霉素A1部分抑制,表明自噬發(fā)揮了促凋亡作用。

    表4 不同濃度丹參酮Ⅱa和巴弗洛霉素A1對HL-60細(xì)胞存活率的影響(±s)

    表4 不同濃度丹參酮Ⅱa和巴弗洛霉素A1對HL-60細(xì)胞存活率的影響(±s)

    注:與丹參酮Ⅱa 0 μmol/L+巴弗洛霉素A1 0 μmol/L組比較,△P<0.05。

    24 h細(xì)胞存活率(%)100.00±0.91 98.44±3.53 51.21±2.36△76.82±3.05△丹參酮Ⅱa(μmol/L)0 03 2 32巴弗洛霉素A1(nmol/L)0 20 0 20

    3 討 論

    目前AML治療主要依賴化療和HSCT,雖然化療使超過80%的年輕患者完全緩解,但5年總生存率不到40%[3]。此外化療會導(dǎo)致骨髓抑制,引起出血和感染[4]。而HSCT要考慮禁忌證、費(fèi)用、配型、移植物抗宿主病等問題[5-7]。以砒霜為代表的中醫(yī)藥在AML治療中有許多成功的應(yīng)用,繼續(xù)深化相關(guān)研究意義重大[8]。痰瘀互阻是急性白血病的主要病因病機(jī),治以“化痰散結(jié)、活血祛瘀”之法可以延長患者生存期,提高臨床療效[9-12]。丹參味苦性微寒,能補(bǔ)血活血祛瘀,涼血清心消癰,有“一味丹參,功同四物”之說?,F(xiàn)代藥理研究顯示,其所含的丹參酮Ⅱa可抑制肺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤生長[13]。本研究中,丹參酮Ⅱa可以抑制HL-60增殖,增加Caspase-3和PARP-1切割,進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡,效果呈時間和濃度依賴性。此外丹參酮Ⅱa會激活A(yù)MPK/mTOR通路引發(fā)自噬,聯(lián)用自噬抑制劑巴弗洛霉素A1會弱化丹參酮Ⅱa的抗白血病作用,表明激活自噬強(qiáng)化了其抗白血病作用。

    自噬異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[14-15]。應(yīng)激壓力下腫瘤細(xì)胞通過自噬來保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[16],但過度自噬引發(fā)自噬性死亡,常與凋亡相伴發(fā)[17]。對于AML,自噬相關(guān)蛋白較正常成熟粒細(xì)胞呈低表達(dá)[18]。小鼠敲除ATG7、ATG8后發(fā)生白血病[19]。AMPK/mTOR通路是調(diào)控能量代謝的重要通路,該通路激活會促進(jìn)分解代謝(自噬)增加能量供給[20]。腫瘤細(xì)胞活性氧水平更接近氧化損傷的閾值,AMPK/mTOR激活后引發(fā)自噬進(jìn)行分解代謝,產(chǎn)能增加,活性氧累積,氧化應(yīng)激活化Caspase系統(tǒng),最終Caspase-3轉(zhuǎn)為Cleaved-Cas?pase-3,切割PARP-1等生物大分子,使腫瘤細(xì)胞死亡[21-22]。

    綜上所述,丹參酮Ⅱa通過誘導(dǎo)HL-60凋亡和自噬發(fā)揮抗白血病作用,AMPK/mTOR可能是介導(dǎo)這一效應(yīng)的重要信號通路,值得進(jìn)一步深入研究。

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