基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探究參附注射液治療心肌頓抑的作用機制*

賈 思 鄧海霞 吳瑞華 陀 鵬

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530022）

心肌頓抑是心肌經(jīng)歷短暫的缺血后心臟功能延遲恢復的一種可逆性損傷，表現(xiàn)為心肌收縮能力的減弱，心臟排血量降低、射血分數(shù)減少等［1］，可發(fā)生在心臟驟停心肺復蘇后、心臟移植、應(yīng)激性心肌病、心臟介入術(shù)后、心絞痛等缺血性心肌疾病中［2］。雖然發(fā)生心肌頓抑的心肌細胞并未發(fā)生壞死，但是可能會引起缺血后左室功能障礙、血流動力學不穩(wěn)定等現(xiàn)象，甚至會導致心力衰竭、肺水腫、猝死等嚴重并發(fā)癥，從而增加病死率［3］。因此如何有效防治心肌頓抑，已經(jīng)成為臨床上亟待解決的問題。心肌頓抑屬于中醫(yī)“胸痹”“心悸”等范疇，基本治法為袪邪治標、活血化瘀、辛溫通陽、瀉濁豁痰、溫陽補氣、益氣養(yǎng)陰、滋陰益腎等。中醫(yī)藥具有多成分、多途徑、多靶點的特性，在防治心血管疾病中有獨特優(yōu)勢。

參附注射液組分為人參和附子，具有回陽救逆、穩(wěn)固營衛(wèi)之功效，主要有效成分有人參皂苷和烏頭類生物堿，可強心、利尿、擴張冠狀動脈血管，同時還能減少心肌耗氧量并降低心臟負荷，主要用于休克、心律失常、心力衰竭等屬陽氣暴脫證者［4-5］。目前對于參附注射液的研究局限于單一的通路機制，對其系統(tǒng)的作用機制研究尚不全面。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，從分子層面系統(tǒng)地分析參附注射液有效成分的作用靶點、生物過程、信號通路等在心肌頓抑中的作用機制。以期為深入研究參附注射液治療心肌頓抑的基礎(chǔ)實驗研究及臨床合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)并提供新思路。

1 材料與方法

1.1 參附注射液有效化合物的收集與篩選 參附注射液由人參和附子提取而成。利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件，收集這兩個藥物的有效化合物。

1.2 參附注射液有效化合物的靶點預測 將收集到的參附注射液有效化合物以Mol2格式上傳到Pharm?mapper服務(wù)器中，選擇藥效團模型，將返回靶點數(shù)設(shè)置為300，得到參附注射液化合物的有效靶點。并將預測出的靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫獲得標準基因名。

1.3 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 選取人參和附子化合物成分前10個靶點，將化合物及相應(yīng)靶點信息上傳到Cytoscape軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖并進行可視化分析，以“節(jié)點”代表成分和靶點，“邊”代表成分與靶點之間的相互作用，獲得化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 心肌頓抑相關(guān)靶點的預測 利用在線文本挖掘服務(wù)器 GeneCards（https：//www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）和CTD（http：//ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫篩選出與心肌頓抑相關(guān)的靶點，以“stunned myocardium”為關(guān)鍵詞進行檢索，收集并整合與心肌頓抑相關(guān)的靶點。

1.5 參附注射液對心肌頓抑的作用靶點預測 將參附注射液化合物靶點和心肌頓抑相關(guān)靶點導入Venny在線分析軟件中，得到參附注射液對心肌頓抑的26個潛在治療靶點。將這26個靶點上傳到SRTING（http：//string-db.org）數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為“Homo sa?piens”，設(shè)置靶點之間相互作用值為0.4，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，并保存為TSV格式。將所得的TSV格式的文件導入Cytoscape軟件進行可視化分析獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 網(wǎng)絡(luò)合并 通過Cytoscape軟件中的Merge功能，對參附注射液化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)與參附注射液對心肌頓抑的作用靶點進行合并，構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病全局性網(wǎng)絡(luò)。

1.7 參附注射液對心肌頓抑作用靶點的富集分析和KEGG通路注釋分析 將“1.5”所得到的交集靶點導入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫中，進行GO分析和KEGG分析，在分析結(jié)果中收集生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞成分（CC）和The Kyoto En-cyclope?dia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析并保存。利用微生信在線網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）將KEGG通路繪制成氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 參附注射液有效化合物的收集 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件，收集到符合條件的43個化合物，其中人參22個，附子21個?；衔锇ǘ圭薮迹╯tigmasterol）、山柰酚（kaempferol）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、人參皂苷Rh2（ginsenoside rh2）等，各化合物的具體信息見表1。

2.2 參附注射液化學成分靶點預測及相互作用 在PharmMapper服務(wù)器中預測表1篩選出的43個參附注射液有效化合物，取結(jié)果中每個化學成分的前10個蛋白，隨后上傳到Uiprot數(shù)據(jù)庫，獲得統(tǒng)一基因名。再將這些蛋白上傳到SRTING在線軟件中，對重復蛋白和非人源蛋白進行剔除，最后獲得74個靶點。將結(jié)果中的靶點蛋白導入到Cytoscape軟件中，構(gòu)建“靶點蛋白相互作用”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）和“化合物-成分靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。

圖1 參附注射液化學成分靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 參附注射液化合物成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表1 參附注射液化合物成分

2.3 參附注射液對心肌頓抑作用靶點 通過Gene?Cards、OMIM和CTD數(shù)據(jù)庫，以“stunned myocardium”為檢索詞，共整合到1 826個疾病靶點。將參附注射液化合物靶點和心肌頓抑作用機制相關(guān)靶點上傳到Ven?ny在線分析軟件中，分析得出26個交集靶點，見圖3。

圖3 參附注射液化學成分靶點與心肌頓抑相關(guān)疾病靶點Venny圖

2.4 參附注射液對心肌頓抑作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“2.3”所獲得的26個交集靶點上傳到STRING在線軟件中，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)并保存TSV格式文件。在Cytoscape軟件中導入TSV文件，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4。參附注射液對心肌頓抑作用的潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)有23個節(jié)點（去除3個無相互作用的靶點），包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、雌激素受體1（ESR1）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶7（CASP7）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）等。

圖4 參附注射液對心肌頓抑作用靶點的蛋白互作圖

2.5 參附注射液對心肌頓抑靶點的全局性網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape軟件中的Merge功能將參附注射液化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)和參附注射液對心肌頓抑作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)合成全局性蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。見圖5。

圖5 參附注射液與心肌頓抑靶點全局性網(wǎng)絡(luò)

2.6 參附注射液對心肌頓抑作用靶點的GO分析和KEGG富集分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫中進行GO分析，以P＜0.05為條件進行篩選，獲得55個生物學過程（BP），包括：序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、凋亡過程負調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、細胞對脂多糖的反應(yīng)、成纖維細胞增殖的正調(diào)控等；15個細胞組成（CC），包括：核質(zhì)、胞質(zhì)、細胞核、線粒體、外泌體等；20個分子功能（MF），包括：絲裂原活化蛋白激酶活性、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白激酶活性等。GO分析見圖6（圖中BP和MF按P值選擇前15個）。在KEGG通路富集分析結(jié)果中，篩選出P＜0.05以及與心肌頓抑直接或間接相關(guān)的通路共12條，包括TNF信號通路（TNF sig?naling pathway）、Foxo信號通路（FoxO signaling path?way）、NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signal?ing pathway）、MAPK 信號通路（MAPK signaling path?way）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等，具體KEGG通路富集分析氣泡圖見圖7。

圖6 參附注射液對心肌頓抑作用靶點的BP、CC、MF分析

圖7 參附注射液對心肌頓抑作用的KEGG氣泡圖

3 討論

心肌頓抑是短暫、可逆的心肌缺血所引發(fā)的心肌功能障礙，常見于心肌梗死、心絞痛、心臟驟停心肺復蘇后、心臟移植等缺血性損傷中［6］。心肌頓抑的發(fā)生可能會導致嚴重的并發(fā)癥，如心力衰竭、惡性心律失常、猝死等，增加患者的死亡率。然而在臨床上，尚未出現(xiàn)確切的心肌頓抑治療指南，沒有加速恢復心肌功能障礙的治療方法［7］。大量研究證實中醫(yī)藥在防治心血管疾病方面具有獨特的優(yōu)勢［8］，它可以從多靶點、多成分、多通路系統(tǒng)地對心肌頓抑的發(fā)生發(fā)展進行干預。參附注射液是防治心血管疾病的常用中成藥，在臨床研究及實驗研究中均證實其具有顯著療效［9］。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出43個有效化合物，包括山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、人參皂苷Rh2（ginsenoside rh2）等。有研究表明［10-12］，這些成分對損傷的心肌細胞具有修復作用。這些化合物都與心肌頓抑的機制相關(guān)，由此我們推測參附注射液可通過這些化合物共同作用于心肌頓抑，發(fā)揮保護性作用。

本研究中獲得26個參附注射液對心肌頓抑的潛在治療靶點，去除掉3個無交互作用的靶點，最終得到23個潛在靶點，故我們推測參附注射液可能通過這23個靶點對心肌頓抑發(fā)揮作用，分析發(fā)現(xiàn)這些靶點共同參與多種生物過程，如EGFR、CASP3、MAPK8和GSTP共同參與凋亡過程的負調(diào)控，EGFR、MAPK1、MAPK8共同參與應(yīng)激反應(yīng)，MAPK14、MAPK8和GSTP1共同參與細胞對脂多糖的反應(yīng)。CASP3是參與細胞凋亡的重要組成部分，對機體的凋亡過程有著重要的調(diào)節(jié)作用；EGFR是上皮生長因子細胞增殖和信號轉(zhuǎn)導的受體，與細胞的增殖、分化、血管生成、細胞凋亡的抑制等過程相關(guān)［13］；絲裂原活化蛋白激酶MAPK1、MAPK8和MAPK14是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘?nèi)的重要介質(zhì)，調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、炎癥反應(yīng)等多種重要的細胞病理生理過程［14］。這些生物學過程與心肌頓抑的發(fā)生機制都存在相互關(guān)系，因此我們推測參附注射液可能通過共同誘導這些基因的表達對心肌發(fā)揮保護性作用。

在KEGG分析中，篩選得到12條信號通路，其中與心肌頓抑密切相關(guān)的通路有Toll樣受體信號通路（TLRs）、Foxo信號通路、NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）。TLRs是介導人體內(nèi)先天免疫和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路［15］。TLRs可通過激活絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB（NF-κB）信號級聯(lián)途徑，促進下游炎性因子的表達，如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF）-α等，從而引起心肌細胞的損傷［16］。Han等［17］研究發(fā)現(xiàn)TLR4-NF-κB通路活化后可使心肌梗死大鼠心肌中的炎癥標志物顯著增加。而在使用藥物對TLR4-NF-κB通路進行抑制后，發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)心肌壞死標志物及炎癥因子均明顯降低，心功能得到改善［18］。

張弛等的實驗研究證實，參附注射液可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來抑制脂多糖介導的黏附分子表達，進而減輕機體的炎癥反應(yīng)［19］。Foxo蛋白參與多種生物學過程，包括抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗凋亡等，可減少心肌誘導的氧化應(yīng)激和細胞凋亡，通過增加抗氧化劑的產(chǎn)生和細胞存活對缺血的心肌發(fā)揮保護作用［20］。Fox家族包含17個亞族，其中Foxo1和Foxo3主要在心臟組織中表達［21］。Sengupta A等［22］在實驗研究中指出，心肌細胞中Foxo1和Foxo3共同缺失會導致抗氧化劑和DNA修復酶減少，從而加重心肌的損傷。NOD樣受體信號通路（NLRs）廣泛存在于人體細胞質(zhì)中，其在機體固有免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［23］。NLPs通過激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導途徑抑制炎性因子的激活。Li H等［24］研究證實NRLs主要通過抑制心肌缺血引起的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，在心臟中起保護作用。因此我們推測，參附注射液有效活性成分可能是通過調(diào)控各大代謝通路，共同發(fā)揮保護心肌頓抑中心肌細胞的作用。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學層面初步預測了參附注射液治療心肌頓抑的有效活性成分、潛在作用靶點、關(guān)鍵信號通路等復雜的機制，為參附注射液的藥理作用提供了理論基礎(chǔ)和新的思路。然而，本研究仍存在一定的局限性，單從網(wǎng)絡(luò)藥理學層面預測了參附注射液對心肌頓抑的作用機制，還需通過臨床及實驗方面的研究進一步證實。因此本研究后期還需要大量的實驗研究加以佐證。