縣域尺度下樣點距離和土壤分類對農(nóng)田土壤細菌多樣性的影響*

周聰聰，于東升?，陸曉松，陳 洋，徐志超，潘 月

（1. 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京 210008；2. 中國科學院大學，北京 100049）

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對生物地球化學循環(huán)和成土過程等均起著重要的調(diào)節(jié)作用[1-3]，被認為是最具潛力反映土壤質(zhì)量的敏感性指標之一[4-5]。受特定因素影響，土壤微生物群落可呈現(xiàn)出相應的空間分布特征[6]。其中，土壤細菌數(shù)量最大、種類繁多，多樣性大于任何其他生物群落[7]。因此，研究土壤細菌多樣性的空間變異性，對制定合理高效的土壤野外調(diào)查采樣方案[8]，定量化研究人為作用下的土壤細菌及其參與的生物地球化學循環(huán)和成土過程等，均具有重要意義。

土壤細菌空間變異性研究在多種尺度上均取得進展。Pasternak 等[9]在干旱半干旱區(qū) 0.5～100 km區(qū)域尺度上的研究表明，地理距離顯著影響土壤細菌群落分布，但在1 cm～500 m 尺度上的影響不顯著。但也有研究指出，在<10 km 的區(qū)域尺度上，土壤細菌物種的多樣性、群落的豐富度在空間分布上的差異并不顯著[10-12]。易祎[13]在東北黑土區(qū)對典型流域農(nóng)田土壤的研究表明，土壤細菌數(shù)量下游與上游和中游的差異顯著，坡中部與坡上部和下部的差異顯著。周賽等[14]研究表明，我國中亞熱帶（浙江、福建、江西、湖南）的毛竹林土壤細菌α 多樣性指數(shù)的地帶性變化趨勢不顯著，但群落相似度在670 km 距離范圍內(nèi)隨著采樣點間距增大而降低。褚海燕等[15]通過分析地理空間距離與群落距離的相關性，發(fā)現(xiàn)華北平原麥田的空間距離對土壤微生物空間分布有重要的作用。

土壤類型對土壤細菌多樣性也具有顯著影響。Grz?dziel 和Ga??zka[16]通過不同類型土壤在100 多年相同管理條件下的微區(qū)試驗研究，證實了土壤類型與微生物豐度和多樣性直接相關。Chen 等[17]針對重慶、湖北和遼寧三個地區(qū)不同類型的水稻土，通過10 周不同處理的水稻盆栽實驗發(fā)現(xiàn)土壤類型是影響氨氧化細菌豐度和群落結構的重要因素。但這些研究或是局限于小范圍的試驗站中、或是分散于廣大的區(qū)域范圍，忽略了空間尺度帶來的自然環(huán)境條件差異對于土壤細菌多樣性影響；且涉及的土壤分類層次僅為高級分類單元——土類，沒有涉及較低級的土壤分類單元（如土壤亞類、土屬、土種等）對土壤細菌多樣性的影響。

樣點空間距離[18-19]和土壤分類粒度[20-21]是衡量土壤調(diào)查精度和樣點代表性的重要指標，但目前兩者對土壤微生物（如細菌）的綜合影響作用并不清楚。因此，本研究以稻-麥輪作農(nóng)田為研究對象，通過實地調(diào)查和采樣，利用16S rDNA 基因測序分析技術，研究土壤細菌多樣性在不同土壤樣點空間距離和土壤分類粒度上的變異性特征，綜合分析樣點空間距離和土壤分類粒度對土壤細菌多樣性的影響，為農(nóng)田土壤微生物研究及其調(diào)查樣點合理布設提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)為江蘇省常熟市（31°33′～31°50′ N，120°33′～121°3′ E），位于長江三角洲地區(qū)前緣，下轄虞山、琴川、莫城、常福3 個街道，支塘、古里、尚湖、辛莊、海虞、沙家浜、梅李、董浜9 個鎮(zhèn)以及高新區(qū)和碧溪新區(qū)，全市總面積1 301 km2[22]。該市屬亞熱帶季風氣候，四季分明，氣候溫和，雨量充沛，年均氣溫17.4 ℃，降水量1 823 mm。除虞山、顧山、福山等山丘外，地形以水網(wǎng)交織的沖積和湖積平原為主，海拔在3～7 m。土壤類型以水稻土和潮土為主，占全市耕地面積97%以上，主要種植水稻、小麥和一些經(jīng)濟作物[23]。

1.2 采樣方案設計

考慮不同土壤類型及其分類粒度（土類、亞類、土屬、土種），按村（<10 km）、鎮(zhèn)（10～20 km）、縣域（>20 km）3 種空間尺度選擇稻麥輪作的8 個農(nóng)田樣區(qū)（S_1 - S_8），并按田塊尺度（<50 m）在每個農(nóng)田區(qū)設計4 個6 m×10 m 相鄰采樣區(qū)，如S_1農(nóng)田區(qū)設計S_11 - S_14 四個采樣區(qū)（圖1）。這8個農(nóng)田區(qū)涉及研究區(qū)主要土壤類型，涵蓋2 個土類，3 個亞類，6 個土屬，7 個土種（表1），分布在尚湖、辛莊和支塘3 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)、6 個村莊。其中尚湖與辛莊相鄰，位于市域西部，而支塘鎮(zhèn)位于市域東南角，與上述兩鎮(zhèn)距離最遠（表2）。

1.3 樣品采集與分析

首先調(diào)查各樣區(qū)農(nóng)田管理信息，如施肥量、小麥與水稻總產(chǎn)量及秸稈還田量等（表3）。在2016年11 月水稻收割后，在各采樣區(qū)按梅花狀采集表層土壤混合樣品，共32 個土壤樣品。土樣在剔除根系后，一份低溫密封貯運，帶回實驗室-80 ℃保存，用于土壤微生物分析；另一份在實驗室風干后用于測定理化性質(zhì)（表4）。

土壤微生物DNA 提取使用MiSeq Reagent Kit v2 試劑盒，按試劑盒操作說明書提?。徊⒉捎铆傊悄z電泳檢測基因組DNA 完整性，Nanodrop 2000檢測基因組DNA 質(zhì)量。對土壤細菌16S rDNA 基因V 4-V 5 區(qū)進行 P C R 擴增，擴增引物采用 F（GTGCCAGCMGCCGCGG）和R（CCGTCAATTCM TTTRAGTTT）。PCR 擴增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增后產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，應用核酸純化磁珠純化，得到一個樣本的原始文庫。對文庫定量、混合、質(zhì)量檢驗后，采用Miseq 平臺進行雙端測序。

表1 各農(nóng)田樣區(qū)土壤類型Table 1 Soil types relative to sample area

表2 各農(nóng)田樣區(qū)相互空間距離Table 2 Spacing of sample areas /km

表3 研究區(qū)主要農(nóng)田管理措施統(tǒng)計特征Table 3 Statistic characteristics of farmland management measures in the study area

表4 研究區(qū)主要土壤理化性質(zhì)統(tǒng)計特征Table 4 Statistic characteristics of physico-chemical properties of the soils in the study area

1.4 多樣性指數(shù)計算

α 多樣性（Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)）表征環(huán)境群落內(nèi)的物種豐度和多樣性。其中，Chao1 指數(shù)用于估計樣品中所含OTU（Operational Taxonomic Unit）數(shù)目，數(shù)值越大代表物種越多，菌群豐度越大。Shannon 指數(shù)（H）和Simpson 指數(shù)（D）均用來估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)：前者數(shù)值越大，菌群多樣性越高，均一性越好；后者數(shù)值越大，菌群多樣性越低。它們的計算方法如下[24-26]：

式中，Sobs表示樣本中觀察到的物種數(shù)目；F1為樣本中數(shù)量只為1 的物種數(shù)目；F2為樣本中數(shù)量只為2 的物種數(shù)目。

式中，Pi為物種i的個體數(shù)目占總個體數(shù)的百分比；S為物種總數(shù)。

式中，Pi為物種i的個體數(shù)目占總個體數(shù)的百分比；S為物種總數(shù)。

β 多樣性表征沿環(huán)境梯度不同生境群落之間物種組成的相異性，其指標 Bray-Curtis 相異度（DBray-Curtis）表示兩個樣本間微生物的群落組成差異，數(shù)值越大，差異越大。計算方法如下[27]：

式中，SA,i和SB,i表示第i個OTU 分別在A 群落和B群落中的計數(shù)；min 表示取兩者最小值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

對16S rDNA V4-V5 檢測區(qū)的原始序列數(shù)據(jù)進行質(zhì)量過濾（去除末尾質(zhì)量低于Q15 的堿基，通過重疊關系拼接成對序列，去除短序列末尾的雜序列以及非特異性擴增片段，根據(jù)堿基質(zhì)量的累加值進行過濾），剔除總堿基錯誤率高于2 的序列后得到1 796 464 個優(yōu)化序列，優(yōu)化序列中Q30 數(shù)據(jù)達到80%以上。使用UPARSE 聚類方法將優(yōu)化序列在相似性≥97%的水平上進行OTU 聚類，并利用RDP數(shù)據(jù)庫[28]進行物種注釋。應用mothur[29]軟件計算土壤細菌α 多樣性（Chao1、Shannon 和Simpson 指數(shù)），應用R 軟件vegan 包進行β 多樣性分析（Bray-Curtis相異度）、層次聚類分析、SIMPER 分析和Mantel分析[30]。

利用土壤細菌α 多樣性指數(shù)的變異系數(shù)CV 與Bray-Curtis 相異度評估3 種不同類型尺度下土壤細菌群落的變異性特征。分別為：（1）空間距離尺度，分別為田塊尺度（<50 m）、鄉(xiāng)村尺度（<10 km）、鄉(xiāng)鎮(zhèn)尺度（10～20 km）、縣域尺度（>20 km）4 種空間距離尺度；（2）土壤分類粒度，分別為土類、亞類、土屬、土種4 種土壤分類粒度；（3）空間距離-土壤分類的綜合尺度，在空間距離尺度上進一步按土類、亞類、土屬進行分組。利用Microsoft Excel 2016 統(tǒng)計分析不同尺度下土壤細菌多樣性指數(shù)的變異系數(shù)，利用IBM Statistics SPSS 22.0 對不同尺度的多樣性進行差異顯著性分析（LSD 法，α=0.05）和啞元相關分析，并采用Origin8.5 軟件制作相應圖件。

2 結果與討論

2.1 研究區(qū)土壤細菌多樣性總體特征

研究區(qū)所有樣點土壤細菌α 多樣性指數(shù)的變異系數(shù)統(tǒng)計特征（表5）表明，Shannon 指數(shù)屬于弱變異，Chao1 指數(shù)和Simpson 指數(shù)屬于中等強度變異。土壤細菌群落組成分析結果（圖2）顯示，在細菌門水平分類下，各樣點主要優(yōu)勢菌群有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）與擬桿菌門（Bacteroidetes），但優(yōu)勢群落相對豐度的占比存在差異。SIMPER 分析結果表明，變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）與擬桿菌門（Bacteroidetes）共同提供了40%～60%群落結構差異的解釋度。

表5 研究區(qū)樣點土壤細菌α 多樣性指數(shù)統(tǒng)計特征Table 5 Statistic characteristics of α diversity index of soil bacteria in the study area

2.2 土壤細菌多樣性在不同土壤分類粒度下的變異特征

各土壤分類粒度下土壤細菌α 多樣性指數(shù)的平均變異系數(shù)計算（圖3）表明，土壤分類時三種多樣性指數(shù)的變異系數(shù)較未分類時均降低。其中，Chao1 指數(shù)變異系數(shù)在土類、亞類、土屬和土種分類粒度上分別降低了1.22%、2.64%、6.55%和7.05%，Shannon 指數(shù)變異系數(shù)分別降低了1.32%、1.71%、2.18%和2.26%，Simpson 指數(shù)變異系數(shù)分別降低了9.25%、11.12%、13.13%和14.05%，各土壤分類粒度的多樣性指數(shù)變異系數(shù)幾乎均小于10%。隨著土壤分類粒度的減小，三種多樣性指數(shù)的變異系數(shù)均有減小趨勢。土壤分類使土壤細菌α 多樣性的變異性降低，并隨著土壤分類粒度的減小，這種變異性越來越小，表明按土壤分類進行布點采樣，土壤細菌α 多樣性分析數(shù)據(jù)更具代表性，分類粒度越小，代表性越強。

從β 多樣性來看，Bray-Curtis 相異度（群落相異度）由高到低依次為不同土類（兩個樣本為不同土類）、土類、亞類、土屬和土種。不同土類分組、土類分組與其他分組差異均達到顯著水平，但土種分組、土屬分組和亞類分組之間差異不顯著（圖4）。表明隨著土壤分類粒度的減小，土壤細菌群落相異度有降低趨勢。土壤分類后采樣使樣點數(shù)據(jù)更具代表性，若分別按土種和土類分類粒度進行布點采樣，土種粒度采樣模式的土壤β 多樣性分析數(shù)據(jù)較土類粒度采樣模式代表性更強。

2.3 土壤細菌多樣性在不同空間距離尺度下的變異性特征

不同空間距離尺度下土壤細菌α 多樣性指數(shù)的變異系數(shù)計算結果（圖5）顯示，三種多樣性指數(shù)的變異系數(shù)均呈現(xiàn)出隨樣點空間距離增加而提升的變化特征，Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)的變異系數(shù)變化范圍分別為3.32%～10.77%、0.81%～3.08%和 7.71%～22.26%。Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)的變異系數(shù)在設定的所有空間距離尺度下幾乎均小于10%，Simpson 指數(shù)變異系數(shù)在田塊（< 50 m）和鄉(xiāng)村（<10 km）尺度下小于10%，鄉(xiāng)鎮(zhèn)（10～20 km）和縣域（>20 km）尺度下大于10%。三種多樣性指數(shù)的變異系數(shù)在鄉(xiāng)鎮(zhèn)尺度（10～20 km）下較鄉(xiāng)村尺度（<10 km）增加最為顯著，表明在此區(qū)域范圍內(nèi)土壤樣點空間距離或樣點密度對農(nóng)田土壤細菌多樣性分析將具有顯著性影響。對細菌群落Bray-Curtis 相異度的分析也具有同樣特點。

不同空間距離尺度下土壤細菌群落的Bray-Curtis 相異度顯示（圖6），細菌群落相異度也呈現(xiàn)出隨樣點空間距離的增加而增大的變化規(guī)律，除鄉(xiāng)鎮(zhèn)（10～20 km）與縣域（>20 km）尺度之間無顯著差異，其他空間距離尺度之間差異顯著。田塊尺度（<50 m）下群落相異度最小，同一田塊內(nèi)土壤細菌群落組成大致相同。群落相異度在縣域尺度（>20 km）未有明顯增加，說明隨著空間距離尺度的擴大，土壤細菌群落結構的差異增大，而且在一定距離之后，差異增加減緩。

2.4 土壤細菌在空間距離-土壤分類綜合尺度下的變異性特征

因在<50 m 范圍內(nèi)為相同土種，>20 km 無相同土類土壤，將土壤樣本在鄉(xiāng)村尺度（<10 km）和鄉(xiāng)鎮(zhèn)尺度（10～20 km）空間距離分類的基礎上，各自按不同土壤分類粒度進行分組，得到兩者綜合尺度下的 α 多樣性指數(shù)的變異系數(shù)和樣本間的Bray-Curtis 相異度（表6）。兩種尺度的共同作用下，土壤細菌α 多樣性指數(shù)的變異系數(shù)和細菌群落相異度較單一尺度均有所降低。鄉(xiāng)鎮(zhèn)尺度（10～20 km）下樣點土壤分類后的α 多樣性指數(shù)變異系數(shù)較鄉(xiāng)村尺度（<10 km）的減少為更明顯，表明在樣區(qū)達到一定空間距離時，考慮土壤分類粒度的樣點布設方案可顯著提升樣點代表性。

在不同空間距離尺度下土壤分類粒度對土壤細菌群落相異度的影響也不同。在鄉(xiāng)村（<10 km）尺度下，細菌群落相異度隨土壤分類粒度的變化有限，在鄉(xiāng)鎮(zhèn)（10～20 km）尺度下，群落相異度隨著土壤分類粒度細化而減小。表明在鄉(xiāng)鎮(zhèn)尺度研究土壤細菌多樣性，調(diào)查樣點布設不僅需關注土壤分類粒度，而且需選擇合適的土壤分類粒度，對提升土壤樣點代表性和調(diào)查精度更為有效。

3 討 論

3.1 土壤細菌群落相異度與土壤分類粒度和空間距離尺度關系比較

上述結果表明土壤分類粒度與空間距離尺度均對土壤細菌群落相異度有影響（圖4、圖6）。兩者與土壤細菌群落相異度的啞元相關分析結果（圖7）顯示，空間距離尺度與細菌群落相異度的Spearman等級相關系數(shù)和Pearson 相關系數(shù)，均遠高于土壤分類粒度，表明樣點空間距離尺度與細菌群落結構差異的相關性較土壤分類粒度更強。利用Bray-Curtis距離矩陣進行層次聚類分析也可直觀看出，研究區(qū)樣本間土壤細菌群落結構相似度與空間距離相關，但因土壤分類的聚集分布并不明顯（圖8）。因此，在農(nóng)田土壤微生物調(diào)查研究中采樣布設方案更多地關注土壤樣點空間距離尺度變化對土壤微生物分析的影響作用。

表6 土壤細菌在空間距離-土壤分類綜合尺度下的多樣性指標變異系數(shù)與Bray-Curtis 相異度Table 6 CVs of soil bacterial α diversity index and Bray-Curtis dissimilarity relative to spacing-classification granularity combination

3.2 土壤理化性質(zhì)差異是空間距離尺度影響細菌多樣性的重要因素

土壤細菌對于土壤環(huán)境的改變是靈敏和顯著的，土壤pH[32]、土壤質(zhì)地和有機質(zhì)等營養(yǎng)元素[33]等均對土壤細菌產(chǎn)生影響。土壤理化性質(zhì)在不同空間距離尺度的差異，是空間距離尺度影響土壤細菌群落結構特征重要因素。黃晶晶[34]、王秀虹等[35-36]在縣域幅度范圍內(nèi)研究表明，土壤pH、土壤質(zhì)地（黏粒、粉粒、砂粒）和有機質(zhì)等屬性的空間變異性，在一定區(qū)域幅度范圍內(nèi)，均隨著樣區(qū)幅度擴大而急速增加，研究區(qū)土壤理化性質(zhì)隨著樣區(qū)空間距離的擴展，空間變異性增強，并且大于隨土壤分類粒度的變化（表7）。

土壤pH 被認為是土壤細菌群落結構的重要預測因子[32]，Mantel 分析也表明pH 與土壤細菌結構的相關性最強（表8）。群落相異度在鄉(xiāng)鎮(zhèn)尺度隨樣點空間距離增大，但在縣域尺度增加微弱，原因可能在于pH 的變異系數(shù)在達到縣域尺度（>20 km）后增加變緩（表7），使得細菌群落結構差異不再擴大。而pH 在土壤分類粒度上變異系數(shù)小，且變化不大，未能體現(xiàn)細菌群落相異度隨土壤分類粒度的變化特征。因此，農(nóng)田土壤理化性質(zhì)尺度變化對土壤細菌群落結構特征的影響，是空間距離尺度對細菌多樣性影響的重要體現(xiàn)。

表7 主要土壤理化性質(zhì)在不同尺度下的變異系數(shù)Table 7 CVs of main soil physico-chemical properties relative to scale in the study area/%

表8 土壤細菌群落結構與土壤理化性質(zhì)和農(nóng)田管理措施的相關性Table 8 Relationship of soil bacterial community structure with soil physico-chemical properties and farmland management measures in the study area

3.3 農(nóng)田管理措施變化是空間距離尺度影響土壤細菌多樣性的重要體現(xiàn)

農(nóng)田管理措施不僅可以影響土壤性質(zhì)，也是影響土壤細菌多樣性的重要因子[37-40]。圖8 中尚湖鎮(zhèn)的3 號農(nóng)田區(qū)與4 號農(nóng)田區(qū)，辛莊鎮(zhèn)的6 號、7 號與8 號農(nóng)田區(qū)分別聚集分布，這可能由于當樣點空間距離達到一定尺度，人類活動按村、鎮(zhèn)等聚集分布，農(nóng)田管理措施發(fā)生了變化。Mantel 分析表明氮肥量、磷肥量、總產(chǎn)量與土壤細菌結構顯著相關（表8），而這些管理措施在鄉(xiāng)村尺度下（<10 km）最為一致（表9），這可能與當?shù)剞r(nóng)技指導隨地域變化有關。但管理措施變異特征在土壤分類粒度上無明顯規(guī)律，甚至出現(xiàn)隨著分類粒度減小，管理措施差異變大的現(xiàn)象，這可能是由于人為因素干擾了土壤分類粒度的尺度效應，相同土屬農(nóng)田因不同地域農(nóng)戶的管理而差異較大，相同土類農(nóng)田因一戶多田管理或按地域分布集中，差異反而較小。因此，農(nóng)田管理措施的地域性差異，是空間距離尺度影響土壤細菌群落結構特征重要因素。

表9 研究區(qū)主要農(nóng)田管理措施在不同尺度下的變異系數(shù)Table 9 CVs of farmland management measures relative to scale/%

4 結 論

常熟市稻麥輪作農(nóng)田土壤細菌α 多樣性指數(shù)中Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)變異系數(shù)總體較低，Simpson 指數(shù)為中等變異性，隨著土壤分類粒度和樣點空間距離的減小而降低。土壤細菌群落相異度隨著土壤分類粒度的減小有降低趨勢，從田塊到鄉(xiāng)鎮(zhèn)尺度隨樣點空間距離增大而顯著性增加，但擴大到縣域尺度增加微弱。兩種尺度共同作用下，土壤細菌α 多樣性指數(shù)的變異系數(shù)和細菌群落相異度較單一尺度均有所降低；但在鄉(xiāng)鎮(zhèn)尺度下樣點土壤分類粒度降低后，α 多樣性指數(shù)變異系數(shù)與群落相異度較鄉(xiāng)村尺度的減少更為明顯。細菌群落相異度與樣點空間距離尺度的相關性較土壤分類粒度更強，土壤理化性質(zhì)和農(nóng)田管理措施在空間上變化是樣區(qū)空間距離尺度影響土壤細菌群落結構的重要因素。因此，農(nóng)田土壤微生物調(diào)查，首先需考慮樣點空間距離尺度的影響，在鄉(xiāng)鎮(zhèn)以上尺度的樣點調(diào)查還需進一步考慮土壤分類粒度，土壤分類粒度越小，樣點越具代表性。研究結果對縣域農(nóng)田土壤微生物多樣性研究及其調(diào)查樣點布設具有積極參考價值。