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    黃曲霉中pyrG篩選標(biāo)記循環(huán)利用的方法

    2021-04-08 04:20:18聶鑫怡王銀春丁霞飛汪世華
    關(guān)鍵詞:尿嘧啶泳道黃曲霉

    聶鑫怡, 薛 楊, 王銀春, 丁霞飛, 汪世華

    (1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2.福建省病原真菌與真菌毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350002)

    乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因URA3/pyrG是一類(lèi)常用的真菌遺傳轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記,其編碼產(chǎn)物是真菌尿嘧啶核苷酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶,該基因突變或敲除會(huì)使乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶失活或缺失,表現(xiàn)為尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷,只能通過(guò)外源添加尿嘧啶或尿嘧啶核苷(尿苷)才能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng).URA3篩選標(biāo)記最早在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)轉(zhuǎn)化中應(yīng)用,后來(lái)應(yīng)用范圍擴(kuò)大到其他酵母科真菌,如白念珠菌(Candidaalbicans)[1-4].由于尿嘧啶生物合成途徑非常保守,在絲狀真菌中也有相似的合成過(guò)程.黃曲霉(Aspergillusflavus)、煙曲霉(A.fumigatus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)和土曲霉(A.terreus)等真菌中的pyrG基因都與釀酒酵母URA3基因同源,在遺傳轉(zhuǎn)化中也得到了廣泛應(yīng)用[5-9].

    除了URA3/pyrG篩選標(biāo)記外,還有一些常見(jiàn)的篩選標(biāo)記,如氮源和碳源營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因、藥物抗性標(biāo)記基因等.在比較菌株性狀時(shí),攜帶不同的篩選標(biāo)記會(huì)造成菌株間遺傳背景的不同和性狀的差異,從而影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性.URA3/pyrG環(huán)出系統(tǒng)的出現(xiàn)解決了這一難題.該系統(tǒng)僅用URA3/pyrG一個(gè)篩選標(biāo)記,配合5-氟乳清酸(5-FOA)的負(fù)篩選,使URA3/pyrG篩選標(biāo)記插入真菌細(xì)胞的基因組-環(huán)出-再插入-再環(huán)出,如此循環(huán),進(jìn)行多次遺傳操作[10-11].但URA3/pyrG環(huán)出系統(tǒng)也存在缺陷,如使用該系統(tǒng)前必須要在URA3/pyrG基因兩端分別插入一段同向重復(fù)序列(direct repeat),該操作過(guò)程繁瑣、耗時(shí),且由于存在兩段同向重復(fù)序列,PCR擴(kuò)增基因重組片段時(shí)特別容易造成引物的錯(cuò)配,出現(xiàn)非特異條帶.此外,URA3/pyrG環(huán)出后會(huì)在基因組上殘留一段重復(fù)序列,該重復(fù)序列是否會(huì)影響菌株的性狀尚未可知.針對(duì)這些問(wèn)題,本研究在黃曲霉中建立了一種新的pyrG篩選標(biāo)記循環(huán)利用的方法.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    黃曲霉WT(Δku70)菌株和CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株由美國(guó)農(nóng)業(yè)部南方研究中心Perng-Kuang Chang教授惠贈(zèng),黃曲霉GHS(pyrG+)菌株由本研究構(gòu)建,構(gòu)巢曲霉FGSC A4菌株(ATCC 38163)和煙曲霉AF293菌株(ATCC MYA-4609)由福建省病原真菌與真菌毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)保存.

    質(zhì)粒pUC18-HA-SumO上攜帶的639 bp的HA-sumOCDS-3′-UTR核苷酸片段由通用生物系統(tǒng)(安徽)公司全基因合成.

    高保真DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶和未染色蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自上海翊圣生物科技公司,DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自東盛生物科技公司,凝膠回收試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品,酵母提取物和瓊脂糖為奧賽公司產(chǎn)品,RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司,預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和HA標(biāo)簽抗體購(gòu)自賽默飛公司,Actin抗體為CST公司產(chǎn)品,5-氟乳清酸、尿嘧啶和尿苷均購(gòu)自上海生工公司.

    1 000×微量元素母液(100 mL):ZnSO4·7H2O 2.2 g,H3BO31.1 g,MnCl2·4H2O 0.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.16 g,CoCl2·5H2O 0.16 g,CuSO4·5H2O 0.16 g, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.11 g,Na4EDTA 5 g,溶于去離子水,過(guò)濾除菌.

    YGT固體培養(yǎng)基(1 L):酵母提取物 5 g,葡萄糖 20 g,1 000×微量元素母液1 mL,瓊脂粉20 g.在YGT培養(yǎng)基中分別加入1 mg·L-1尿嘧啶和尿苷即為YGTUU液體培養(yǎng)基.

    本研究所用引物見(jiàn)表1.

    表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

    1.2 GHS(pyrG+)重組菌株的構(gòu)建

    以尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株為出發(fā)菌,構(gòu)建GHS(pyrG+)重組菌株,構(gòu)建策略如圖1所示.步驟如下:以黃曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株基因組DNA為模板,用引物P1和P2擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 171 bp的sumO基因上游非轉(zhuǎn)錄區(qū)5′-UTR片段;利用引物P3和P4從煙曲霉AF293菌株基因組DNA中擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 890 bp的pyrG表達(dá)元件;利用引物P5和P6從構(gòu)巢曲霉FGSC A4菌株基因組DNA中擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 510 bp的3′-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子gpdA(p)片段;利用引物P7和P8從質(zhì)粒pUC-18-HA-SumO中擴(kuò)增長(zhǎng)度為639 bp的片段HA-sumOCDS-3′-UTR;將上述各片段用重疊PCR法連接到一起,以巢式引物P9和P10擴(kuò)增長(zhǎng)度為5 146 bp的融合片段5′-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumOCDS-3′-UTR,轉(zhuǎn)化黃曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株原生質(zhì)體,通過(guò)DNA同源重組使融合片段整合到基因組的sumO基因座上替換掉內(nèi)源的sumO基因,在不含尿嘧啶和尿苷的復(fù)蘇培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)3 d后篩選、鑒定,獲得GHS(pyrG+)重組菌株.

    CA14PTs(Δku70ΔpyrG)為出發(fā)菌株,GHS(pyrG+)為按常規(guī)方法以pyrG作為遺傳篩選標(biāo)記對(duì)黃曲霉sumO基因位點(diǎn)改造后的重組菌株,GHS(pyrG-)為pyrG篩選標(biāo)記被剔除后的黃曲霉sumO基因位點(diǎn)改造重組菌株.“5′-UTR”表示黃曲霉sumO基因上游非轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA片段,“pyrG”表示來(lái)源于煙曲霉的表達(dá)元件,“gpdA(p)”表示來(lái)源于構(gòu)巢曲霉的3′-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子序列,“HA”表示來(lái)源于流感病毒的紅細(xì)胞凝集素表面抗原決定簇HA標(biāo)簽蛋白編碼序列,“sumO CDS”表示來(lái)源于黃曲霉的翻譯產(chǎn)物為SumO蛋白的編碼核苷酸序列,“3′-UTR”表示黃曲霉sumO基因下游非翻譯區(qū)DNA片段.圖1 GHS(pyrG+)和GHS(pyrG-)重組菌株構(gòu)建策略示意圖Fig.1 Schematic diagram of the strategy for the construction of GHS(pyrG+) and GHS(pyrG-) strains

    1.3 pyrG遺傳篩選標(biāo)記的剔除

    以GHS(pyrG+)重組菌株為受體菌,剔除pyrG篩選標(biāo)記,構(gòu)建GHS(pyrG-)重組菌株,構(gòu)建策略如圖1所示.步驟如下:利用引物P1和P11從黃曲霉GHS(pyrG+)重組菌株基因組中擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 171 bp的sumO基因上游非轉(zhuǎn)錄區(qū)5′-UTR片段;利用P12和P6從黃曲霉GHS(pyrG+)重組菌株基因組中擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 510 bp的3′-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子gpdA(p)片段;將上述兩個(gè)片段用重疊PCR法連接到一起,用巢式引物P9和P13擴(kuò)增長(zhǎng)度為2 372 bp的融合片段5′-UTR-gpdA(p),轉(zhuǎn)化黃曲霉GHS(pyrG+)重組菌株原生質(zhì)體,在含有2 mg·mL-15-氟乳清酸、1 mg·L-1尿苷和1 mg·L-1尿嘧啶的復(fù)蘇培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)3 d.抽提轉(zhuǎn)化子基因組DNA,用引物P3和P4擴(kuò)增pyrG片段進(jìn)行PCR鑒定,用引物P9和P13擴(kuò)增5′-UTR-gpdA(p)片段并用引物P9進(jìn)行測(cè)序分析.

    1.4 營(yíng)養(yǎng)缺陷表型觀察

    取103個(gè)黃曲霉GHS(pyrG-)重組菌株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的新鮮孢子,分別接種于YGT和YGTUU固體培養(yǎng)基平板的中心點(diǎn),37 ℃持續(xù)培養(yǎng)3 d,用佳能IXUS相機(jī)(16.1 MEGA PIXELS)觀察并拍照.

    1.5 免疫雜交分析

    黃曲霉總蛋白的提取、電泳和免疫雜交方法參考文獻(xiàn)[5].

    2 結(jié)果與分析

    2.1 表達(dá)HA-SumO的黃曲霉重組菌株GHS(pyrG+)的構(gòu)建

    構(gòu)建GHS(pyrG+)重組菌株的過(guò)程如圖2A所示.將5′-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumOCDS-3′-UTR融合片段轉(zhuǎn)化黃曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株原生質(zhì)體,并篩選、鑒定GHS(pyrG+)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,抽提總蛋白并用HA標(biāo)簽抗體和Actin抗體進(jìn)行Western blot免疫雜交,分析黃曲霉GHS(pyrG+)重組菌株中的HA-SumO的表達(dá)水平和SUMO化修飾狀態(tài),結(jié)果如圖2B所示.GHS(pyrG+)重組菌株中可以檢測(cè)到HA-SumO蛋白單體的條帶,被SUMO化修飾的多種靶標(biāo)蛋白條帶也能被檢測(cè)到,呈現(xiàn)階梯狀分布,而對(duì)照CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株和WT(Δku70)菌株中都檢測(cè)不到特異性雜交條帶.

    A.構(gòu)建5′-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS-3′-UTR融合片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜(M為DS10 000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),泳道1為長(zhǎng)度約1.2 kb的sumO基因上游非轉(zhuǎn)錄區(qū)5′-UTR片段,泳道2為長(zhǎng)度約1.9 kb的pyrG表達(dá)元件,泳道3為長(zhǎng)度約1.5 kb的gpdA(p)片段,泳道4為長(zhǎng)度約0.6 kb的HA-sumO CDS-3′-UTR片段,泳道5為長(zhǎng)度約5.2 kb的5′-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS-3′-UTR融合片段);B.免疫雜交檢測(cè)GHS(pyrG+)重組菌體內(nèi)的SUMO化修飾狀態(tài)[泳道1為CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株總蛋白,泳道2為WT(Δku70)菌株總蛋白,泳道3為GHS(pyrG+)重組菌株總蛋白].圖2 GHS(pyrG+)重組菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證Fig.2 Construction and identification of the GHS(pyrG+) strain

    2.2 GHS(pyrG+)重組菌株中pyrG遺傳篩選標(biāo)記的剔除

    分別從黃曲霉GHS(pyrG+)重組菌株基因組中擴(kuò)增長(zhǎng)度約1.2 kb的sumO基因上游非轉(zhuǎn)錄區(qū)5′-UTR片段和1.5 kb的3′-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子gpdA(p)片段(圖3A),并用重疊PCR法連接到一起,以巢式引物P9和P13擴(kuò)增長(zhǎng)度約2.4 kb的融合片段5′-UTR-gpdA(p)(圖3B),轉(zhuǎn)化黃曲霉GHS(pyrG+)原生質(zhì)體,并篩選、鑒定GHS(pyrG-)重組菌株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子.經(jīng)鑒定,挑取的12個(gè)轉(zhuǎn)化子中有3個(gè)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,陽(yáng)性率為25%.如圖3C所示,用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,GHS(pyrG+)基因組DNA中可擴(kuò)增出約1.9 kb的pyrG片段,而T3#、T7#和T11#轉(zhuǎn)化子的基因組和陰性對(duì)照中則無(wú)法擴(kuò)增pyrG片段;同時(shí),利用引物P9對(duì)轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#中擴(kuò)增出的5′-UTR-gpdA(p)片段進(jìn)行測(cè)序分析表明,陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的5′-UTR-gpdA(p)片段的實(shí)際序列與理論序列一致(圖3D).這些結(jié)果說(shuō)明:GHS(pyrG+)基因組上整合的pyrG篩選標(biāo)記已被剔除,且剔除過(guò)程不依賴pyrG篩選標(biāo)記兩端的同向重復(fù)序列,剔除pyrG篩選標(biāo)記后GHS(pyrG-)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組上也未殘留重復(fù)序列;除了pyrG篩選標(biāo)記外,GHS(pyrG-)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子與GHS(pyrG+)菌株的遺傳背景一致.

    A.PCR擴(kuò)增5′-UTR片段(泳道1)和gpdA(p)片段(泳道2)的瓊脂糖凝膠電泳圖譜(M為DS2 000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn));B.重疊PCR擴(kuò)增>5′-UTR-gpdA(p)融合片段(泳道1、2)的瓊脂糖凝膠電泳圖譜(M為DS5 000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn));C.GHS(pyrG-)重組菌株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定[M為DS2 000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),泳道1的模板為蒸餾水,泳道2和3的模板為CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株基因組,泳道4的模板為GHS(pyrG+)重組菌株基因組,泳道5、6和7的模板分別為GHS(pyrG-)重組菌株T3#、T7#和T11#轉(zhuǎn)化子基因組];D.GHS(pyrG-)重組菌株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組擴(kuò)增5′-UTR-gpdA(p)產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果的序列比對(duì).圖3 GHS(pyrG-)重組菌株的構(gòu)建和篩選Fig.3 Construction and identification of the GHS(pyrG-)strain

    2.3 GHS(pyrG-)重組菌株的pyrG營(yíng)養(yǎng)缺陷表型

    轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#在YGTUU固體培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)出細(xì)密的菌絲,而在YGT固體培養(yǎng)基上則不能正常生長(zhǎng),呈現(xiàn)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷表型(圖4A).這一結(jié)果證明,GHS(pyrG-)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#的營(yíng)養(yǎng)缺陷型是正確的.

    A.GHS(pyrG-)重組菌株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷表型鑒定;B.免疫雜交分析GHS(pyrG-)重組菌株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的SUMO化修飾狀態(tài)[泳道1為蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),泳道2為GHS(pyrG+)重組菌株總蛋白,泳道3為WT(Δku70)菌株總蛋白,泳道4、5和6分別為GHS(pyrG-)重組菌株轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#的總蛋白].圖4 GHS(pyrG-)重組菌株的性狀表型和SUMO化修飾狀態(tài)Fig.4 Phenotype and SUMO modification status of the GHS(pyrG-) strain

    2.4 GHS(pyrG-)重組菌株的HA-SumO的表達(dá)水平

    分別提取WT(Δku70)菌株、GHS(pyrG+)重組菌株以及GHS(pyrG-)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#的總蛋白,利用HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫雜交分析,從蛋白水平上比較pyrG篩選標(biāo)記剔除前后SUMO化修飾狀態(tài)是否有差異,并以SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果作為上樣量對(duì)照.從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,WT(Δku70)菌株檢測(cè)不到特異性雜交條帶,而GHS(pyrG+)重組菌株和GHS(pyrG-)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子T3#、T7#和T11#都特異性地表達(dá)了HA-SumO單體蛋白,體內(nèi)還有許多被SUMO化修飾的不同分子質(zhì)量的靶標(biāo)蛋白,呈現(xiàn)階梯式的分布,且GHS(pyrG+)重組菌株和GHS(pyrG-)各個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子SumO的表達(dá)量和表達(dá)模式之間沒(méi)有差異(圖4B).這些結(jié)果說(shuō)明,按本研究的方法剔除pyrG篩選標(biāo)記不影響菌株的蛋白表達(dá)模式.

    3 討論

    本研究建立了一種新的乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因pyrG遺傳篩選標(biāo)記循環(huán)利用的方法,僅需一個(gè)pyrG遺傳篩選標(biāo)記的循環(huán)利用即可實(shí)現(xiàn)多次遺傳轉(zhuǎn)化操作,避免了不同遺傳篩選標(biāo)記的差異對(duì)真菌遺傳背景和性狀的影響;同時(shí),該方法在剔除基因組中的pyrG遺傳篩選標(biāo)記時(shí)不需要依賴同向重復(fù)序列和在URA/pyrG兩端插入重復(fù)序列,操作簡(jiǎn)單易行,且剔除pyrG篩選標(biāo)記后在基因組上不會(huì)殘留重復(fù)序列.

    由于許多真菌都以URA3/pyrG作為遺傳篩選標(biāo)記,本方法除了用于黃曲霉外,也可應(yīng)用到以乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因URA3/pyrG表達(dá)元件作為遺傳篩選標(biāo)記的其他真菌中(應(yīng)用方法如圖5所示),使得重組菌株重新獲得尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷,再次作為出發(fā)菌株循環(huán)利用URA3/pyrG篩選標(biāo)記進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,為多基因、多位點(diǎn)的真菌遺傳改造提供支持.

    “X DNA”表示真菌基因組上需要利用pyrG進(jìn)行改造的任一DNA片段,“up”和“down”分別表示pyrG整合位點(diǎn)上游和下游DNA片段.圖5 pyrG篩選標(biāo)記循環(huán)利用示意圖Fig.5 Schematic diagram for the pyrG selectable marker recycling system

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