基于GC-MS的福建柏萜類揮發(fā)物及其器官差異分析

周成城, 黃 霞, 謝德金, 楊德明, 榮俊冬, 何天友, 鄭郁善,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院,福建 福州 350002)

福建柏[Fokieniahodginsii(Dunn) Henry et Thomas]為柏科福建柏屬，為我國(guó)特有種屬，分布在福建、廣東、云南、廣西等南部省份[1].其樹干通直、樹型優(yōu)美、四季常青、適應(yīng)性強(qiáng)、抗性較好、材性穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)細(xì)膩，是我國(guó)優(yōu)良的材用—景觀兩用型樹種之一[2].福建柏精油中含有大量萜類化合物，其中主要成分是萜類揮發(fā)物[3-4].但對(duì)福建柏各組織部位中的揮發(fā)性萜類化合物的成分組成尚不清楚[4-6].本研究對(duì)福建柏鱗葉、樹皮和根中萜類揮發(fā)物的差異性進(jìn)行分析，旨在鑒別福建柏不同部位萜類揮發(fā)物的種類和含量，為從分子層面上探究福建柏萜類揮發(fā)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為35年生生長(zhǎng)良好、無(wú)病蟲害的福建柏鱗葉、樹皮(包括周皮和韌皮部)和根，于2019年8月采集于福建省福州市永泰縣大湖國(guó)有林場(chǎng)的福建柏天然林，用無(wú)菌水把材料清洗干凈并用無(wú)菌濾紙擦干，再用錫箔紙包裹后放進(jìn)干冰中，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?3個(gè)部位材料取自同一區(qū)域內(nèi)年齡相近、長(zhǎng)勢(shì)相同的3株福建柏，各設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù).

1.2 方法

1.2.1 物質(zhì)提取和SPME進(jìn)樣 從-80 ℃冰箱中取出樣品，采用液氮研磨，保證樣本不變質(zhì).樣本保存于液氮中，并快速稱取10 g，分別加入2 mL NaCl飽和溶液和10 μL內(nèi)標(biāo)溶液(2,6-二甲基-4-庚酮)，置于15 mL頂空瓶中.在老化溫度為250 ℃下處理5 min，在加熱溫度60 ℃下處理10 min.將SPME萃取頭插入樣品瓶頂空部分，收集20 min后將萃取頭收起，并插入氣相色譜進(jìn)樣口.

1.2.2 GC-MS檢測(cè) 色譜條件：采用DB-5MS的色譜柱，柱流速為1 min-1，不分流，前進(jìn)樣口溫度為250 ℃.升溫程序：40 ℃保持1 min，以5 ℃·min-1的速度升至280 ℃并保持 3 min.采集模式為全掃描，離子源溫度為230 ℃，以電子轟擊離子化，電離電壓值為70 eV，MS四級(jí)桿的溫度為150 ℃.

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 將質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)(NIST 14)和線性保留指數(shù)進(jìn)行比較，以鑒定萜類揮發(fā)物.采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)萜類揮發(fā)物濃度平均值和標(biāo)準(zhǔn)差.利用R中3個(gè)R包(pheatmap, venndiagram和scatterplot)制作萜類揮發(fā)物含量的熱圖、韋恩圖和PCA主成分分析圖.利用在線軟件MetaboAnalyst 4.0 (https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行PLS-DA分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 福建柏萜類揮發(fā)物的種類鑒定

以福建柏葉片、樹皮以及根為材料進(jìn)行了GC-MS分析，得到福建柏萜類揮發(fā)物的總離子流圖(圖1)，分離出142個(gè)色譜峰，共檢測(cè)出45種萜類揮發(fā)物.按照碳架結(jié)構(gòu)分類，將45種萜類揮發(fā)物分成五大類，包括10種單萜烯、10種單萜類衍生物、17種倍半萜、6種倍半萜類衍生物、2種二萜類衍生物.檢測(cè)結(jié)果中的萜類揮發(fā)物信息如表1所示.

表1 福建柏萜類揮發(fā)物分類1)Table 1 Classification of terpenoid volatiles in F.hodginsii

圖1 福建柏萜類揮發(fā)物的總離子流圖Fig.1 Ion chromatogram of terpenoid volatiles in F.hodginsii

對(duì)3個(gè)器官的萜類揮發(fā)物總量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)樹皮中揮發(fā)物含量最高(相對(duì)含量為55.01%)，葉中次之(相對(duì)含量為34.74%)，根中最少(相對(duì)含量為10.25%).表明萜類揮發(fā)物總量呈現(xiàn)明顯的器官差異.對(duì)每一類萜類揮發(fā)物的總量作進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)單萜烯和倍半萜是含量較高的兩大類物質(zhì)，分別占萜類揮發(fā)物總量的42.93%和53.87%.其中單萜烯在葉中含量最高，倍半萜在樹皮中含量最高.

對(duì)每一種萜類揮發(fā)物的含量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)α-蒎烯、γ-杜松烯、δ-杜松烯、長(zhǎng)葉烯、順式菖蒲烯和檸檬烯是福建柏萜類揮發(fā)物中的主要成分.由圖2可以看出：這6種物質(zhì)在3個(gè)器官中的含量均在60%以上，但含量差異較大.在葉中α-蒎烯含量最高，達(dá)到51.52%；在根中長(zhǎng)葉烯含量最高，為44.96%；在樹皮中主要成分含量的差異較小，γ-杜松烯含量最高，為26.14%.與其他幾個(gè)主要成分相比，檸檬烯在根和樹皮中的含量也相對(duì)較低，順式菖蒲烯則在樹皮中沒有被檢測(cè)到.

圖2 福建柏器官中萜類揮發(fā)物主要物質(zhì)相對(duì)含量比例 圖3 福建柏3個(gè)器官萜類揮發(fā)物數(shù)量示意圖 Fig.2 Main components and proportions of terpenoid volatiles in F.hodginsii Fig.3 Venn diagram of terpenoid volatiles detected in 3 organs of F.hodginsii

對(duì)福建柏45種萜類揮發(fā)物進(jìn)行韋恩圖分析(圖3)，其中27種物質(zhì)在3個(gè)器官中均被檢測(cè)出來；4種物質(zhì)只在樹皮中被檢測(cè)到，分別是雙環(huán)烯庚酮、反式卡拉曼烯、丹參酮和欖香醇，但含量都較低.α-長(zhǎng)葉蒎烯在根中被檢測(cè)到，葉中沒有檢測(cè)到；葉中含有萜類揮發(fā)物組分.乙烯基環(huán)已酮、3-松樟酮、香附烯酮和紫杉醇在根和樹皮中均被檢測(cè)到；左旋乙酸冰片酯和順式菖蒲烯均在葉和根中被檢測(cè)到；p-薄荷三烯、環(huán)己二烯苯甲醛、匹諾酮、馬鞭草烯酮、雙環(huán)水芹烯、β-波旁烯和桉油烯醇在葉和樹皮中均被檢測(cè)到.因此，在福建柏3個(gè)器官中，樹皮的萜類揮發(fā)物種類是最豐富的.

2.2 福建柏萜類揮發(fā)物的器官差異分析

45種物質(zhì)含量的熱圖分析如圖4所示.按照熱圖左側(cè)聚類關(guān)系，萜類揮發(fā)物可以分為4組，分別以藍(lán)色、黃色、紅色、綠色4種顏色表示，并分別命名為分組Ⅰ、分組Ⅱ、分組Ⅲ和分組Ⅴ(圖4).

G1～G6：根樣本6個(gè)重復(fù).Y1～Y6：葉樣本6個(gè)重復(fù).P1～P6：樹皮樣本6個(gè)重復(fù).圖4 福建柏萜類揮發(fā)物含量的熱圖分析Fig.4 Heat map analysis of terpenoid volatiles in F.hodginsii

GroupⅠ共有11種萜類揮發(fā)物，包括3-蒈烯(D4)、γ-松油烯(D5)、匹諾酮(D12)等5種單萜烯及其衍生物，以及長(zhǎng)葉烯(D31)、δ-杜松烯(D35)、石竹烯氧化物(D38)等5種倍半萜及其衍生物.這組物質(zhì)在樹皮單個(gè)器官中的含量差異最顯著，在葉和根中的含量相對(duì)較低，甚至不含有.GroupⅡ共有24種萜類揮發(fā)物，該組物質(zhì)在根中的含量相對(duì)較低，差異明顯.該組還能分為兩個(gè)亞組：以α-蒎烯(D1)、莰烯(D2)、檸檬烯(D7)、β-蒎烯(D8)等12種物質(zhì)組成一個(gè)亞組，該亞組的物質(zhì)主要以單萜烯及其衍生物為主，這些物質(zhì)在葉和莖的含量差異不大；以馬鞭草烯酮(D17)、γ-杜松烯(D21)、γ-丁二烯(D25)等12種物質(zhì)組成另一個(gè)亞組，該亞組的物質(zhì)主要以倍半萜及其衍生物為主，這些物質(zhì)在“莖—葉—根”中的含量呈“高—中—低”階梯式變化.GroupⅢ只有左旋乙酸冰片酯(D19)和順式菖蒲烯(D32)兩種物質(zhì)，在樹皮中沒有檢測(cè)到，在葉和根中的含量較高.GroupⅣ共有8種萜類揮發(fā)物，主要有長(zhǎng)葉烯(D31)、β-紅沒藥烯(D36)、香附烯酮(D43)、α-長(zhǎng)葉蒎烯(D45)等，這些物質(zhì)在葉中的含量較低，在根和莖中的含量較高.

2.3 福建柏特征萜類揮發(fā)物的鑒定

基于熱圖中聚類分析的結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)福建柏萜類揮發(fā)物的物質(zhì)含量進(jìn)行PCA分析(圖5)，以3個(gè)器官(各6個(gè)重復(fù)樣品)為類別進(jìn)行分析，結(jié)果表明福建柏不同器官在PCA模型中的3個(gè)維度都存在明顯分離，且3個(gè)器官的重復(fù)樣本均沒有重合.在第一主成分上的貢獻(xiàn)度達(dá)到59.83%，第二主成分的貢獻(xiàn)度為28.18%，第三主成分的貢獻(xiàn)度為4.52%.第一和第二主成分的總貢獻(xiàn)度已經(jīng)超過85%，已經(jīng)能區(qū)分出3個(gè)器官的差異.而第三主成分主要是用于區(qū)分各器官6個(gè)重復(fù)樣本的差異性，結(jié)果表明在樹皮中6個(gè)重復(fù)樣本的差異較小，而在葉和根中差異較大.說明福建柏萜類揮發(fā)物在樹皮中的含量波動(dòng)小，在葉和根中的含量波動(dòng)大.

G1～G6：根樣本6個(gè)重復(fù).Y1～Y6：葉樣本6個(gè)重復(fù).P1～P6：樹皮樣本6個(gè)重復(fù).圖5 福建柏萜類揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of terpenoid volatiles in F.hodginsii

對(duì)福建柏45種萜類揮發(fā)物進(jìn)行PLS-DA模型分析(圖6).在交互檢驗(yàn)中，3個(gè)主成分的R2和Q2都超過0.8，接近1.0，表明PLS-DA模型沒有過擬合.在置換檢驗(yàn)中，每100個(gè)重復(fù)中就有一個(gè)統(tǒng)計(jì)樣本的統(tǒng)計(jì)顯著性P=0.01，說明PLS-DA模型的數(shù)據(jù)可靠.

A.置換檢驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)直方圖；B.主成分交互檢驗(yàn)結(jié)果.圖6 福建柏萜類揮發(fā)物PLS-DA模型的檢驗(yàn)Fig.6 Validation of terpenoid volatiles in F.hodginsii by PLS-DA model

利用PLS-DA分析結(jié)果中變量重要性投影值(VIP分?jǐn)?shù))可以鑒別福建柏器官之間的差異特征性萜類揮發(fā)物.VIP分?jǐn)?shù)大于1.0的物質(zhì)在鑒別過程中起著重要的作用，有助于解釋萜類揮發(fā)物在器官間的差異.從圖7可知，鑒定出45種萜類揮發(fā)物中有15種揮發(fā)物的VIP分?jǐn)?shù)大于1.0，在福建柏葉、根、樹皮3個(gè)器官中的含量都有明顯差異.這15種物質(zhì)分別為β-波旁烯(D26)、p-薄荷三烯(D9)、乙烯基環(huán)已酮(D15)、布藜烯(D29)、檸檬烯(D7)、β-蒎烯(D8)、α-水芹烯(D10)、3-松樟酮(D16)、長(zhǎng)葉烯(D31)、α-衣蘭烯(D34)、α-蒎烯(D1)、桉油烯醇(D39)、α-長(zhǎng)葉蒎烯(D45)、雙環(huán)水芹烯(D22)、β-紅沒藥烯(D36).單萜烯及其衍生物只有5種，二萜衍生物1種，倍半萜及其衍生物有9種，說明倍半萜類物質(zhì)在福建柏不同器官中的含量差異顯著.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，β-波旁烯、p-薄荷三烯的VIP分?jǐn)?shù)排名前二，分別為1.55和1.51，兩者在根中均沒有被檢測(cè)到，在葉中含量相對(duì)較高.但從總含量分析可知，這兩種物質(zhì)的含量相對(duì)較低.乙烯基環(huán)已酮和布藜烯的VIP值較大，在葉中含量較低，在根中含量較高，這兩種物質(zhì)總含量也較低.在剩余的7種物質(zhì)中，檸檬烯、β-蒎烯、長(zhǎng)葉烯、α-蒎烯和雙環(huán)水芹烯這5種物質(zhì)的VIP分?jǐn)?shù)大于1.0，物質(zhì)含量占總含量的比重也較高，占45種萜類揮發(fā)物總量的40.07%.

圖7 PLS-DA分析中VIP分?jǐn)?shù)(VIP>1.0)的物質(zhì)排序Fig.7 Rating of VIP scores (VIP>1.0) by PLS-DA analysis

3 討論和小結(jié)

植物揮發(fā)物一般是次生代謝產(chǎn)物，具有明顯的組織特異性[7-8].其中萜類化合物是主要的植物揮發(fā)物之一，目前已鑒定出結(jié)構(gòu)的萜類化合物超過25 000種[9].本試驗(yàn)采用GC-MS技術(shù)對(duì)福建柏鱗葉、樹皮和根3個(gè)器官的萜類揮發(fā)物成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明單萜類和倍半萜類化合物是福建柏萜類揮發(fā)物中的主要成分，其中α-蒎烯、γ-杜松烯、δ-杜松烯、長(zhǎng)葉烯、順式菖蒲烯和檸檬烯是福建柏萜類揮發(fā)物中的主要物質(zhì).α-蒎烯的含量最高，這與潘炯光等[4]、盧鈺鐸等[5]的研究結(jié)果一致；其他物質(zhì)含量較高的結(jié)果與前人研究存在一定差異，可能是由于福建柏的樹齡、采樣部位、采樣時(shí)間、采樣地點(diǎn)等不同[4-6].而研究[4-5]表明福建柏葉片中檸檬烯的含量也較高，與本研究的結(jié)果相符合.說明在福建柏葉片中檸檬烯的合成量大且穩(wěn)定.此外，在華山松、沙地柏、杉木、馬尾松、歐洲赤松等裸子植物的葉片中，檸檬烯也是含量較高的萜類化合物[10-13].

從福建柏3個(gè)器官的萜類揮發(fā)物總量分析可知：福建柏樹皮中檢測(cè)到的萜類揮發(fā)物種類最多，總量最大；僅在單個(gè)器官中含有雙環(huán)烯庚酮、反式卡拉曼烯、丹參酮、欖香醇和α-長(zhǎng)葉蒎烯，含量都較低.說明在福建柏中大部分萜類揮發(fā)物在3個(gè)器官中都能夠被檢測(cè)出，但在各器官的含量有明顯差異性.PCA分析顯示前3個(gè)貢獻(xiàn)度超過85%，表明3個(gè)器官中萜類揮發(fā)物的含量存在明顯差異，且在樹皮中的樣品重復(fù)差異小，說明樹皮中的萜類揮發(fā)物含量波動(dòng)較小.綜上可知，福建柏在樹皮中的萜類揮發(fā)物具有明顯的組織特異性，可能是由于本試驗(yàn)選取的植物材料為20年生福建柏，成年樹種的樹干粗壯且生命活動(dòng)旺盛，根系發(fā)達(dá)，木質(zhì)化程度高，物質(zhì)合成速率高且穩(wěn)定.在樹皮中檢測(cè)到較多的萜類揮發(fā)物，可能是次生代謝物質(zhì)合成的.因?yàn)楸驹囼?yàn)樹皮樣本主要是韌皮部，韌皮部是有機(jī)物運(yùn)輸?shù)耐緩絒14]，因而福建柏樹皮中萜類代謝物有差異性且含量較高.

利用PLS-DA模型對(duì)每種萜類揮發(fā)物在器官間的差異作進(jìn)一步分析，結(jié)果表明檸檬烯、β-蒎烯、長(zhǎng)葉烯、α-蒎烯和雙環(huán)水芹烯5種物質(zhì)在福建柏器官間有明顯差異性且含量較高.α-蒎烯對(duì)人體有鎮(zhèn)痛、殺菌消毒、抗病毒、使人鎮(zhèn)靜等作用，有益于人體的身心健康[15].在福建柏中α-蒎烯含量最高，其同分異構(gòu)體β-蒎烯的含量也較高(尤其在樹皮中)，這對(duì)福建柏的藥用價(jià)值開發(fā)有一定的指導(dǎo)意義.