蒼附導(dǎo)痰丸含藥血清調(diào)控大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬的作用

謝蓬蓬 劉佳玥 曾蕾

摘 要 目的：研究蒼附導(dǎo)痰丸含藥血清調(diào)控大鼠卵巢顆粒細(xì)胞（GCs）自噬的作用。方法：將3月齡SD大鼠分為生理鹽水組（生理鹽水，灌胃）、卵巢刺激素（FSH）注射組（10.71 IU/kg，皮下注射）和蒼附導(dǎo)痰丸高、中、低劑量灌胃組[0.5、1、2 mg/g（以生藥量計(jì)），灌胃]，每組6只，每天皮下注射/灌胃給藥1次，連續(xù)3天;末次給藥后，于腹主動脈采血，獲取各組大鼠的含藥血清。將大鼠GCs分為空白對照組、模型組、FSH組（陽性對照）和蒼附導(dǎo)痰丸高、中、低劑量組，除空白對照組直接加入生理鹽水組大鼠血清100 μL外，其余各組均先給予丙酸睪丸酮誘導(dǎo)以復(fù)制自噬模型，然后模型組加入生理鹽水組大鼠血清100 μL，各給藥組分別加入對應(yīng)藥物組含藥血清100 μL。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組細(xì)胞上清液中雌二醇（E2）、孕激素（P）的含量，采用Western blot法檢測各組GCs中磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）蛋白的相對表達(dá)量;采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測各組細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR和自噬相關(guān)因子Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62 mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組細(xì)胞上清液中E2含量以及細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.01），Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，F(xiàn)SH組和蒼附導(dǎo)痰丸中、高劑量組細(xì)胞上清液中E2含量顯著升高，細(xì)胞中Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62 mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;各給藥組細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：蒼附導(dǎo)痰丸可能是通過激活PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白及其mRNA的表達(dá)，從而抑制GCs的自噬。

關(guān)鍵詞 蒼附導(dǎo)痰丸;卵巢顆粒細(xì)胞;自噬;PI3K/Akt/mTOR通路

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）05-0547-05

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effect of Cangfu daotan pill （CDP） containing serum on autophagy of ovarian granulosa cells （GCs） of rat. METHODS： Three-month-old SD rat were divided into normal saline group （normal saline， ig）， FSH injection group （10.71 IU/kg， ih）， CDP irrigation high-dose， medium-dose and low-dse groups [0.5， 1， 2 mg/g（by crude drug），ig]， with 6 rats in each group. They were given relevant medicine subcutaneously/intragastrically， once a day， for consecutive 3 days. After last medication， blood sample was collected from the abdominal aorta to obtain drug-containing serum. GCs of rat were divided into blank control group， model group， FSH group （positive control） and CDP high-dose， medium-dose and low-dose groups. The autophagy model was induced by giving testosterone propionate， except that the blank control group was directly added with 100? ? μL serum of normal saline group. Then model group was given 100 μL serum of normal saline group， and administration groups were given 100 μL drug-containing serum of corresponding drug group. The contents of estradiol （E2） and progesterone （P） in supernatant of cells were determined by ELISA. Western blot assay was used to detect protein expression of PI3K， Akt and mTOR in cells. The mRNA expression of PI3K， Akt， mTOR， Beclin 1， LC3Ⅰ， LC3Ⅱ and p62 were detected by RT-PCR. RESULTS： Compared with blank control group， the content of E2 in supernatant， relative mRNA and protein expression of PI3K， Akt and mTOR were decreased significantly in model group （P<0.01）， while relative mRNA expression of Beclin 1， LC3Ⅰ and LC3Ⅱ were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the content of E2 in supernatant were significantly increased in FSH group， CDP medium-dose and high-dose groups， while relative mRNA expression of Beclin 1， LC3Ⅰ， LC3Ⅱ and p62 were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; relative mRNA and protein expression of PI3K， Akt and mTOR were increased significantly in administration groups （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： CDP can inhibit autophagy of GCs by activating related protein and mRNA expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

KEYWORDS? ?Cangfu daotan pill; Ovarian granulosa cells; Autophagy; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

卵泡發(fā)育障礙是多囊卵巢綜合征、卵巢早衰、不孕癥等諸多婦科疾病的主要原因[1]。目前，上述疾病的西醫(yī)治療手段以激素等藥物為主，存在不良反應(yīng)多、患者易復(fù)發(fā)等不足[2]，故針對卵泡發(fā)育障礙相關(guān)疾病探討更加有效、安全的治療措施，具有重要的臨床意義。近年來，中藥在卵泡發(fā)育障礙相關(guān)疾病方面的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注[3]。蒼附導(dǎo)痰丸作為婦科常用方劑，可安全、有效地治療多囊卵巢綜合征、卵巢早衰等疾病，其機(jī)制可能與改善性激素[如雌二醇（E2）、孕激素（P）]水平、促進(jìn)卵泡發(fā)育有關(guān)[4]，但具體機(jī)制尚未明確。

研究表明，卵泡的發(fā)育與卵巢顆粒細(xì)胞（GCs）自噬的穩(wěn)態(tài)平衡有關(guān)，而GCs的自噬受諸多細(xì)胞因子（如Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62）的調(diào)控[5]。存在于卵母細(xì)胞中的磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）是重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，其激活后的產(chǎn)物可促使蛋白激酶B（Akt）磷酸化，使其下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）活化，從而影響GCs的增殖、凋亡[6]。PI3K/Akt/mTOR通路是自噬研究最廣泛的信號通路之一，已有研究表明，激活該通路可抑制GCs自噬，從而維持卵泡的正常發(fā)育及功能[7-8]。可見，通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)節(jié)GCs自噬，有望成為治療卵巢發(fā)育障礙疾病的新靶點(diǎn)。有鑒于此，本研究基于PI3K/Akt/mTOR通路和自噬相關(guān)因子，探討蒼附導(dǎo)痰丸調(diào)控大鼠GCs自噬的作用，以期為卵泡發(fā)育障礙相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：JEM-1000型透射電子顯微鏡（日本SanYo公司）、BT25S型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）、Rotofix 32A型離心機(jī)（德國Hettich公司）、MK3型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）、ECO 48型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（英國PCRmax公司）、BioDoc-IT型凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）、UV-6100S型紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）、HH-501S水浴鍋（上海赫田科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：蒼附導(dǎo)痰丸（由蒼術(shù)12 g、香附12 g、枳殼12 g、陳皮12 g、茯苓15 g、甘草6 g組成，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院熬制而成，每袋200 mL，按生藥量計(jì)質(zhì)量濃度為1 g/mL），卵巢刺激素（FSH，美國Invitrogen公司），丙酸睪丸酮（TP）、DMEM/F12培養(yǎng)基、化學(xué)發(fā)光試劑盒、cDNA合成試劑盒、甘油醛-3-硫酸脫氫酶（GAPDH）抗體以及E2、P酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（美國Life Technology公司，批號分別為WP20147、WP20489、WP21138、WP22467、WP20028、WP10267、WP71890），10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、蛋白裂解液、2.5%戊二醛、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）、山羊抗大鼠PI3K多克隆抗體、山羊抗大鼠Akt多克隆抗體、山羊抗大鼠mTOR多克隆抗體、山羊抗大鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、TRIzol試劑、BCA試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號分別為00251450、00242682、00143679、01271398、03462477、05472588、04462976、05862874、15562672、14422598、06460571、02432319、01442466），PCR引物[賽默飛世爾科技（中國）有限公司設(shè)計(jì)合成]，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色劑、PBST溶液（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為BSD-GS88900、BSD-GS45907）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物包括3月齡雌性SD大鼠30只，體質(zhì)量為（300±50） g，用于含藥血清的制備;1月齡雌性SD大鼠15只，體質(zhì)量為（200±40） g，用于大鼠GCs的原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動物均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2018-0034。所有動物均飼養(yǎng)于溫度（22±2） ℃、相對濕度50%的動物房。

2 方法

2.1 大鼠GCs的制備

參考文獻(xiàn)[9]方法，取1月齡的SD大鼠15只，處死后取出卵巢，刺破卵巢上的成熟卵泡以收集卵泡液;將卵泡液加入含青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)基中洗滌，以1 000 r/min離心5 min后，棄上清，向沉淀中加適量DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打混勻，制成細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL的GCs懸液，備用。

2.2 大鼠含藥血清的制備

參考文獻(xiàn)[10]方法，取3月齡的SD大鼠30只，隨機(jī)分為生理鹽水組（生理鹽水，灌胃給藥）、FSH注射組（10.71 IU/kg，皮下注射給藥;劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得）和蒼附導(dǎo)痰丸高、中、低劑量灌胃組[0.5、1、2 mg/g（按生藥量計(jì)），灌胃給藥;劑量分別為臨床等效劑量的5、10、20倍]，每組6只。各組大鼠每天皮下注射/灌胃給藥1次，連續(xù)3天。各組大鼠均在末次給藥后，于腹主動脈采血，置于含有枸櫞酸鈉的離心管中，混勻后，以3 000 r/min離心5 min，取上清液，于56 ℃水浴條件下滅活補(bǔ)體并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，于-20 ℃下保存，備用。

2.3 分組、造模和給藥

取“2.1”項(xiàng)下GCs懸液適量，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、FSH組（陽性對照）和蒼附導(dǎo)痰丸高、中、低劑量組，除空白對照組細(xì)胞加入“2.2”項(xiàng)下生理鹽水組的大鼠血清100 μL外，其余各組細(xì)胞均先加入TP（100 nmol/L）并于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h以復(fù)制GCs自噬模型，再向模型組細(xì)胞中加入“2.2”項(xiàng)下生理鹽水組大鼠血清100 μL，向FSH組和蒼附導(dǎo)痰丸各劑量組細(xì)胞中分別加入“2.2”項(xiàng)下FSH注射組和蒼附導(dǎo)痰丸各劑量灌胃組的大鼠含藥血清100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.4 細(xì)胞上清液中E2、P含量的檢測

采用ELISA法進(jìn)行檢測。取“2.1”項(xiàng)下GCs懸液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、造模和給藥，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。取各組細(xì)胞上清液適量，按照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書方法操作后，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長下檢測各組細(xì)胞上清液中E2、P的含量。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白相對表達(dá)量的檢測

采用Western blot法檢測。取“2.1”項(xiàng)下GCs懸液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、造模和給藥，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。在細(xì)胞中加入蛋白裂解液于碎冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心10 min后，收集上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，于沸水浴中變性5 min。取變性后的蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，以5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h;加入PI3K抗體、Akt抗體、mTOR抗體（稀釋度均為1 ∶ 1 000）孵育2 h后;以PBST清洗3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 200），室溫孵育2 h;以PBST清洗13次，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像。采用Image proplus 6.0軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值來表示目的蛋白的相對表達(dá)量。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR、Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62 mRNA相對表達(dá)量的檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取“2.1”項(xiàng)下GCs懸液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、造模和給藥，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。采用TRIzol法[11]分別提取各組細(xì)胞中的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)于260、280 nm波長下檢測RNA的純度和濃度后，使用cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度信息見表1）。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）包括：cDNA模板4 μL、上/下游引物各2 μL、無核酸酶水2 μL、熒光染料10 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。使用Image J v1.5.1軟件分析結(jié)果，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算PI3K、Akt、mTOR、Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62 mRNA的相對表達(dá)量。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 細(xì)胞中自噬小體的觀察

采用透射電鏡進(jìn)行觀察。取“2.1”項(xiàng)下GCs懸液適量按“2.3”項(xiàng)下方法分組、造模和給藥，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞培養(yǎng)液以1 000 r/min離心5 min后，棄上清液，取沉淀以2.5%戊二醛溶液于室溫下固定1 h以上;以PBS漂洗后，加入1%四氧化鋨溶液于室溫下固定1 h;再以50%、70%丙酮溶液各脫水1次后，進(jìn)行包埋、切片（厚度約1 μm）及染色（3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色），然后于透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞中自噬小體，并計(jì)數(shù)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蒼附導(dǎo)痰丸含藥血清對細(xì)胞上清液中E2、P含量的影響

與空白對照組比較，模型組細(xì)胞上清液中E2含量顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，F(xiàn)SH組和蒼附導(dǎo)痰丸中、高劑量組細(xì)胞上清液中E2含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;各組細(xì)胞上清液中P含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表2。

3.2 蒼附導(dǎo)痰丸含藥血清對細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型組細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白的相對表達(dá)量均顯著顯降低（P<0.01）;與模型組比較，F(xiàn)SH組和蒼附導(dǎo)痰丸中、高劑量組細(xì)胞中上述蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表3。

3.3 蒼附導(dǎo)痰丸含藥血清對細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR、Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62 mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型組細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低，Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62 mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，F(xiàn)SH組和蒼附導(dǎo)痰丸各劑量組細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高，F(xiàn)SH組和蒼附導(dǎo)痰丸中、高劑量組細(xì)胞中Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62 mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

4 討論

近年來，在卵泡發(fā)育障礙相關(guān)疾病中應(yīng)用療效佳、副作用少的中藥進(jìn)行治療日益受到重視[11]。卵巢發(fā)育障礙相關(guān)的疾病，多屬于中醫(yī)“閉經(jīng)”“不孕”等范疇[12]。婦科常用方劑蒼附導(dǎo)痰丸是由蒼術(shù)、香附、枳殼、陳皮、茯苓、甘草等組成，具有健脾化痰、活血調(diào)經(jīng)、理氣散結(jié)的功效，相關(guān)研究表明其可有效改善閉經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、不孕等卵巢發(fā)育障礙所致的疾病[13]。已有研究表明，卵泡發(fā)育障礙與GCs異常激活的自噬密切相關(guān)，GCs自噬會導(dǎo)致卵泡的提前閉鎖，引起卵泡發(fā)育障礙，造成卵泡分泌性激素的功能失調(diào)，從而引發(fā)一系列臨床癥狀，而該過程受到自噬相關(guān)基因、多種細(xì)胞因子以及信號通路的調(diào)控[14-16]。PI3K/Akt/mTOR通路是目前研究較為廣泛的信號通路之一，PI3K在細(xì)胞因子、缺氧等因素的影響下可激活A(yù)kt，活化后的Akt又可激活下游的mTOR，從而抑制GCs的自噬[17-18]。Beclin-1、LC3、p62是常見的自噬標(biāo)志物：Beclin-1蛋白是自噬體形成的必備物質(zhì)，其表達(dá)下調(diào)會抑制自噬的發(fā)生，因此Beclin-1的表達(dá)可反映自噬的活性;LC3蛋白包括LC3Ⅰ、LC3Ⅱ兩種形式，可與Beclin-1蛋白共同參與自噬體的形成，已被作為自噬體的特異性標(biāo)記物;p62蛋白在自噬過程中，會不斷地被降解，若自噬活性降低，則p62會在細(xì)胞中積累，因而p62是反映自噬活性的重要標(biāo)志物[19-20]?；诖?，本研究通過檢測GCs中PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的相對表達(dá)量以及Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62 mRNA的相對表達(dá)量，以反映GCs的自噬情況。

本研究將TP作用于GCs后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清液中E2的含量以及細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR、p62 mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低，Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高，推測TP可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路的激活來促使GCs發(fā)生自噬，因而可模擬卵泡發(fā)育障礙相關(guān)疾病的激素紊亂狀態(tài)。經(jīng)藥物處理后發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，F(xiàn)SH組和蒼附導(dǎo)痰丸各劑量組細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;FSH組和蒼附導(dǎo)痰丸中、高劑量組細(xì)胞上清液中E2含量均顯著升高，細(xì)胞中Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62 mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

綜上所述，蒼附導(dǎo)痰丸可能通過激活PI3K/Akt/mTOR通路，從而抑制GCs的自噬。這提示蒼附導(dǎo)痰丸可能通過上述機(jī)制改善性激素水平，從而發(fā)揮治療卵泡發(fā)育障礙相關(guān)疾病的作用。

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（收稿日期：2020-09-27 修回日期：2020-11-25）

（編輯：唐曉蓮）