基于斑馬魚模型與中醫(yī)藥整合藥理學(xué)平臺(tái)研究天麻的抗癲癇作用及潛在機(jī)制

裴文強(qiáng)，單 毅，張友剛, ，賈獻(xiàn)慧，汪海洋，王曉靜，田青平，韓利文，姚慶強(qiáng)

基于斑馬魚模型與中醫(yī)藥整合藥理學(xué)平臺(tái)研究天麻的抗癲癇作用及潛在機(jī)制

裴文強(qiáng)1，單 毅1，張友剛1, 2，賈獻(xiàn)慧1，汪海洋1，王曉靜1，田青平2，韓利文1*，姚慶強(qiáng)1

1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 256200 2. 山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001

利用斑馬魚模型和中醫(yī)藥整合藥理學(xué)平臺(tái)（TCMIP），探究天麻抗癲癇的主要活性成分及潛在的作用機(jī)制。采用健康發(fā)育至72 h的AB系斑馬魚幼魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以氨茶堿誘導(dǎo)形成癲癇模型，觀察天麻對(duì)斑馬魚癲癇樣行為的改善作用；利用TCMIP篩選天麻抗癲癇的靶點(diǎn)，構(gòu)建天麻與癲癇的蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，繪制藥材-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)；利用Autodock vina軟件對(duì)活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。天麻對(duì)氨茶堿誘導(dǎo)的斑馬魚的癲癇樣行為發(fā)生頻率具有顯著改善作用（＜0.05）。通過(guò)TCMIP v2.0整合分析發(fā)現(xiàn)，天麻抗癲癇的核心靶點(diǎn)有25個(gè)，天麻素、天麻醚苷、谷甾醇、棕櫚酸、西托糖苷可能是天麻抗癲癇的主要活性成分；這些活性成分可以直接作用于相應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的平衡、維持神經(jīng)元細(xì)胞正常電生理活動(dòng)并影響酮體生成。天麻對(duì)癲癇樣癥狀具有明顯的改善作用，其抗癲癇的潛在機(jī)制可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的平衡、神經(jīng)元細(xì)胞的電生理穩(wěn)態(tài)和酮體的生成有關(guān)，為天麻的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

天麻；癲癇；斑馬魚；整合藥理學(xué)；天麻素；天麻醚苷；谷甾醇；棕櫚酸；西托糖苷

癲癇是一種由多種原因引起的復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常伴隨運(yùn)動(dòng)、感覺、植物神經(jīng)、意識(shí)等障礙，嚴(yán)重危害人類的健康。隨著我國(guó)人口老齡化，老年人群中癲癇發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的創(chuàng)新藥物研發(fā)進(jìn)展緩慢，現(xiàn)有的抗癲癇藥物不良反應(yīng)較大，因此，尋找新型、高效、低毒的抗癲癇藥物仍然是臨床迫切需要解決的問(wèn)題[1]。

天麻為蘭科植物天麻Bl.的干燥塊莖，主產(chǎn)于湖北、四川、陜西等地[2]?！侗静菥V目》中記載天麻“眼黑頭旋，風(fēng)虛內(nèi)作，非天麻不能治。天麻乃定風(fēng)草，故為治風(fēng)之神藥”。研究發(fā)現(xiàn)，天麻對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用，具有抗驚厥、防止癲癇大發(fā)作、鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛等作用[3-4]。中醫(yī)臨床治療癲癇的處方中，其核心藥味均有天麻[5]。但天麻抗癲癇的具體物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制仍有待深入挖掘。

目前用于癲癇疾病研究的模型主要為大鼠和小鼠模型，在大規(guī)模藥物篩選方面具有局限性且成本較高。斑馬魚作為一種新興的模式動(dòng)物，基因組與人類同源性達(dá)到87%。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚中可觀察到嚙齒動(dòng)物類似的癲癇表型，且斑馬魚產(chǎn)卵量高、實(shí)驗(yàn)周期短、成本低，可以實(shí)現(xiàn)高通量篩選[6-8]。中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（TCMIP）作為一個(gè)專業(yè)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具，整合了中醫(yī)藥百科全書（ETCM）等優(yōu)質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)資源，通過(guò)人工智能、網(wǎng)絡(luò)可視化等先進(jìn)的方法形成了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以為研究天麻抗癲癇的潛在作用機(jī)制提供強(qiáng)大的數(shù)據(jù)支撐和計(jì)算輔助[9]。本研究采用模式動(dòng)物斑馬魚觀察天麻對(duì)癲癇發(fā)作的保護(hù)作用，并利用TCMIP平臺(tái)分析其潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

AB型斑馬魚，由山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，飼養(yǎng)于斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，溫度設(shè)定為28 ℃，pH 6.8～7.5，14 h光照/10 h黑暗，用豐年蟲早晚飼喂2次。實(shí)驗(yàn)所用幼魚均由健康雌雄魚以2∶1比例自然交配而得。

1.2 藥品與試劑

天麻（批號(hào)20191103）購(gòu)自安徽六安，由山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院韓利文副研究員鑒定為蘭科植物天麻Bl.的干燥塊莖；氨茶堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）、丙戊酸鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）購(gòu)自阿拉丁試劑公司；天麻素（批號(hào)B21243，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自源葉生物；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3 儀器

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生公司）；LC-30A液相色譜系統(tǒng)、Shim-pack GIST C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，2 μm）（日本島津公司）；SZX-16型體視熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；SPX-300B-G型博訊光照培養(yǎng)箱（上?；巧锟萍加邢薰荆?。

2 方法

2.1 天麻提取物的制備及含量測(cè)定

天麻用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，稱取10 g天麻粉末，置于500 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 80%乙醇，加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮，真空干燥，得到天麻提取物，于4 ℃保存，臨用前用蒸餾水稀釋至所需濃度。

按照《中國(guó)藥典》2020年版方法進(jìn)行測(cè)定，以乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，以天麻素為對(duì)照品，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算，天麻提取物中天麻素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.24%。

2.2 藥液的配制

精密稱定氨茶堿，溶于蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液；精密稱定丙戊酸鈉，溶于蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的溶液。于4 ℃保存?zhèn)溆?，臨用前用蒸餾水稀釋至所需濃度。

2.3 斑馬魚實(shí)驗(yàn)

將正常孵化的受精后72 h（hours post- fertilization，hpf）斑馬魚幼魚轉(zhuǎn)移至6孔板中，設(shè)置模型組、丙戊酸鈉（0.25 mg/mL）組和天麻提取物（0.1、1.0、10.0 mg/mL）組，每組10條。各給藥組加入相應(yīng)藥物預(yù)處理24 h后，各組再加入氨茶堿（2 mg/mL）造模4 h，觀察斑馬魚幼魚活動(dòng)情況，記錄斑馬魚抽搐頻率（1 min內(nèi)發(fā)生抽搐的次數(shù)）。

2.4 天麻活性成分和癲癇相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

以“天麻”為關(guān)鍵詞，在TCMIP v2.0藥材數(shù)據(jù)庫(kù)功能模塊中檢索獲得天麻的活性成分及靶點(diǎn)；以“癲癇”“癲癇痙攣”“癲癇性發(fā)作”“癲癇持續(xù)狀態(tài)”為關(guān)鍵詞在疾病相關(guān)分子庫(kù)模塊進(jìn)行檢索，獲取癲癇相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.5 天麻與癲癇靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用（protein- protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMIP v2.0的中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘功能模塊構(gòu)建天麻與癲癇靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲担远戎?、?jié)點(diǎn)緊密度、節(jié)點(diǎn)介度的2倍中位數(shù)卡值，獲得核心節(jié)點(diǎn)。將篩選到的天麻與癲癇的共同靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。度值越高，相應(yīng)核心節(jié)點(diǎn)的重要性越高。

2.6 核心靶點(diǎn)基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將“2.5”項(xiàng)下得到的核心靶點(diǎn)分別導(dǎo)入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）和Reactome（https:// reactome.org/）進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。

2.7 藥材-成分-核心靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在中藥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制挖掘結(jié)果界面中自定義關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)可視化功能區(qū)，繪制網(wǎng)絡(luò)圖，將“2.5”項(xiàng)下補(bǔ)充的天麻與癲癇的共同靶點(diǎn)添加到網(wǎng)絡(luò)圖中。

2.8 天麻活性成分與抗癲癇相關(guān)靶點(diǎn)的分子對(duì)接

將天麻活性成分和抗癲癇相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，運(yùn)用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）找到活性成分的3D結(jié)構(gòu)，進(jìn)行能量最低處理。將從Uniprot（https://www.uniprot.org/）中得到的蛋白名稱輸入RCSB PDB（https://www.rcsb.org/）中，得到關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，進(jìn)行純凈、加氫、加電荷等處理，運(yùn)用Autodock Vina[10]進(jìn)行分子對(duì)接。

2.9 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 天麻對(duì)癲癇斑馬魚的保護(hù)作用

氨茶堿可刺激內(nèi)源性腎上腺素和去甲腎上腺素的釋放，可引起斑馬魚運(yùn)動(dòng)失調(diào)、抽搐引起的背部扭曲等癲癇癥狀，常用于制備斑馬魚癲癇模型[11]，而加入丙戊酸鈉后，斑馬魚癲癇樣癥狀明顯減輕[12]。如圖1所示，1.0、10.0 mg/mL天麻提取物能夠顯著抑制斑馬魚幼魚的癲癇樣抽搐（＜0.05），呈劑量相關(guān)性，表明天麻對(duì)斑馬魚的癲癇樣發(fā)作具有一定的保護(hù)作用。

與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.2 天麻活性成分及癲癇相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

如表1所示，共收集到天麻的21個(gè)活性成分，分別為天麻素、天麻醚苷、谷甾醇、香草醛、琥珀酸、西托糖苷等，其中7個(gè)活性成分未檢索到候選靶點(diǎn)，故未列出；共有233個(gè)候選靶點(diǎn)。通過(guò)疾病相關(guān)分子庫(kù)共獲得癲癇疾病描述的相關(guān)靶點(diǎn)共97個(gè)，其中“癲癇”20個(gè)、“癲癇性發(fā)作”1個(gè)、“癲癇痙攣”7個(gè)、“癲癇持續(xù)狀態(tài)”69個(gè)。

3.3 天麻與癲癇靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

如圖2所示，天麻與癲癇靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)有55個(gè)節(jié)點(diǎn)，度值越高，其在網(wǎng)絡(luò)中的作用越高。度值排名前10的節(jié)點(diǎn)分別為核受體輔激活因子1（nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、糖皮質(zhì)激素受體（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NFKB1）、核受體輔激活因子2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、鈣調(diào)蛋白1（calmodulin 1，CALM1）、雌激素受體（androgen receptor，AR）、雌激素受體2（estrogen receptor 2，ESR2）、-甲基--天冬氨酸受體2A（-methyl--aspartate receptor 2A subunit，GRIN2A）、電壓門控鈉通道-8α亞型（mus musculus voltage-gated sodium channel type 8α，SCN8A）。此外，還有5個(gè)節(jié)點(diǎn)為天麻與癲癇的共同靶點(diǎn)，分別為γ-氨基丁酸A受體（γ-aminobutyric acid，GABRA1）、4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（4-aminobutyrate aminotransferase，ABAT）、醛脫氫酶5家族A1（aldehyde dehydrogenase 5 family, member A1，ALDH5A1）、電壓門控鈉通道-1α亞型（mus musculus voltage-gated sodium channel type 1α，SCN1A），提示這些靶點(diǎn)為天麻抗癲癇的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表1 天麻中的活性成分

綠色為中藥的靶點(diǎn)；紫色代表疾病與中藥的共同靶點(diǎn)；繽紛紅色代表疾病靶點(diǎn)

3.4 核心靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID進(jìn)行GO分析，得到＜0.05的生物學(xué)功能條目共72條，其中生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）各39、13、19條，按照重要性選擇前5條分別進(jìn)行可視化分析，如圖3所示。將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Reactome Pathway進(jìn)行KEGG分析，共得到105條通路，將前30條進(jìn)行可視化操作，如圖4所示，涉及核受體轉(zhuǎn)錄過(guò)程（nuclear receptor transcription pathway）、基因轉(zhuǎn)錄途徑（generic transcription pathway）、化學(xué)突觸傳遞（transmission across chemical synapses）、β細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控（regulation of β-cell development）、L1和錨蛋白類的相互作用（interaction between L1 and ankyrins）、細(xì)胞內(nèi)受體的泛素化修飾（SUMOylation of intracellular receptors）、γ-氨基丁酸受體的激活（GABA receptor activation）、門冬氨酸受體的釋放及谷氨酸的結(jié)合與活化（unblocking of NMDA receptors，glutamate binding and activation）、27-羥基膽固醇合成膽汁酸和膽鹽（synthesis of bile acids and bile salts via 27-hydroxycholesterol）等通路。

圖3 天麻抗癲癇核心靶點(diǎn)的GO分析

圖4 天麻抗癲癇核心靶點(diǎn)的KEGG分析

3.5 藥材-成分-核心靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

如圖5所示，天麻的7種成分（天麻醚苷、天麻、谷甾醇、香草醛、棕櫚酸、西托糖苷、琥珀酸）主要通過(guò)作用于NCOA1、NR3C1、ESR1、GABRA1等靶點(diǎn)以及膽汁酸、膽汁酸鹽的合成和循環(huán)、γ-氨基丁酸受體的激活、門冬氨酸受體的釋放、細(xì)胞內(nèi)受體的泛素化修飾、核受體傳導(dǎo)、琥珀酸半醛脫氫等通路，從而發(fā)揮抗癲癇作用。

“□”為藥材，“◇”為活性成分，“○”為核心靶點(diǎn)，“△”為通路，“”為疾病

3.6 分子對(duì)接結(jié)果

在PubChem中尋找“藥材-成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中活性成分對(duì)應(yīng)的小分子，與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，小分子與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能越低，越可能發(fā)揮更大的作用。如表2所示，谷甾醇與電壓門控鉀離子通道KCNQ2及NCOA1、棕櫚酸與CALM1、西托糖苷與KCNQ2及NCOA2、天麻醚苷與KCNQ2、CALM1、NCOA2、NCOA1、GRIN2A，天麻素與CALM1、NCOA2、GRIN2A均具有低于原配體的結(jié)合能。天麻素、天麻醚苷與SCN5A和ALDH5A1具有較低且相近的結(jié)合能，提示這些活性分子可能通過(guò)作用于相關(guān)靶點(diǎn)，從而發(fā)揮抗癲癇作用。結(jié)合能較低的活性分子和靶點(diǎn)蛋白對(duì)接結(jié)果如圖6所示，活性分子都能很好地嵌入到靶點(diǎn)蛋白的活性口袋中。

4 討論

大腦神經(jīng)元的異常放電是癲癇的典型病因，與神經(jīng)元突觸的興奮性和抑制性遞質(zhì)的平衡相關(guān)。生理狀態(tài)下，神經(jīng)元突觸興奮與抑制性遞質(zhì)平衡，神經(jīng)元膜保持穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)興奮性遞質(zhì)過(guò)多或抑制性遞質(zhì)過(guò)少時(shí)，膜的穩(wěn)定性發(fā)生變化，產(chǎn)生異常放電。GABA和谷氨酸分別為最常見的抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[13]?；蜃儺悤?huì)導(dǎo)致早發(fā)性癲癇和智力障礙[14]；基因變異能夠加速電流變化、降低門控、減慢神經(jīng)元的激活并產(chǎn)生更小的電流振幅，從而改變突觸受體介導(dǎo)的抑制性突觸后膜電流的時(shí)間進(jìn)程，促進(jìn)超興奮性，產(chǎn)生癲癇或加劇癲癇[15]，表明神經(jīng)元抑制性遞質(zhì)受損會(huì)導(dǎo)致癲癇。谷氨酸受體在突觸可塑性、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，當(dāng)谷氨酸門控通道Ca2+通透性發(fā)生改變時(shí)，mRNA前體編輯的程度可能影響癲癇發(fā)作[16]。本研究結(jié)果顯示，在PPI和“藥材-成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中，GABRA1、GABRA3、GABRA4、GABRA5、CALM1、GRIK1、GR1A4、ALDH5A1、ABAT均與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)有關(guān)。GR1A4會(huì)通過(guò)天冬氨酸的釋放[17-18]、谷氨酸的結(jié)合與活化，從而編碼谷氨酸受體亞基的表達(dá)，增加癲癇發(fā)病率[19]。Cash等[20]通過(guò)對(duì)ALDH5A1?/?小鼠進(jìn)行研究，證實(shí)是一個(gè)編碼線粒體NAD＋依賴的琥珀酸半醛脫氫酶的基因，可催化GABA分流途徑；當(dāng)缺乏時(shí)，編碼GABAA受體的模板數(shù)量減少，GABA保持未成熟狀態(tài)，發(fā)揮興奮性作用[21]。ABAT是GABA分解的關(guān)鍵酶，當(dāng)ABAT表達(dá)受到抑制時(shí)，GABA水平升高，對(duì)癲癇具有一定的保護(hù)作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，天麻素和谷甾醇可能通過(guò)直接作用于GABRA、GRIA、ABAT、ALDH5A等靶點(diǎn)，參與GABA和谷氨酸的代謝調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮抗癲癇作用。此外，天麻素也可能通過(guò)作用于CALM1參與神經(jīng)元的修復(fù)，從而發(fā)揮抗癲癇作用[23]。

表2 分子對(duì)接結(jié)果

圖6 天麻主要活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接

天麻素可能通過(guò)作用于SCN和KCN相關(guān)受體保證離子轉(zhuǎn)運(yùn)的正常進(jìn)行，維持膜的穩(wěn)定性，從而來(lái)發(fā)揮抗癲癇作用。癲癇異常電生理活動(dòng)的基礎(chǔ)是離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)控相關(guān)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)癲癇的發(fā)生發(fā)展有一定的影響。鈉離子通道可啟動(dòng)電神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?，編碼鈉離子通道α亞基的5種基因突變可導(dǎo)致癲癇[24]，鈉離子通道阻滯劑可以用來(lái)治療局灶性癲癇[25]。鉀離子通道調(diào)節(jié)大腦中神經(jīng)元和非神經(jīng)元的電活動(dòng)，是癲癇發(fā)作易感性的重要決定因素[17]，KCNQ2可以調(diào)節(jié)參與中樞神經(jīng)元M電流的過(guò)程[26]，基因突變會(huì)導(dǎo)致良性家族性新生兒驚厥[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，天麻素可能通過(guò)間接作用于SCN8A，抑制神經(jīng)細(xì)胞自發(fā)性和重復(fù)性放電，維持神經(jīng)元正常的生理活動(dòng)[28-29]。

天麻素、天麻醚苷、谷甾醇、西托糖苷可能通過(guò)作用于NCOA1和NCOA2參與膽汁酸和膽汁酸鹽的合成及循環(huán)，從而參加體內(nèi)酮的代謝過(guò)程，發(fā)揮抗癲癇作用。生酮、高脂、低糖飲食對(duì)癲癇具有治療作用[30-31]。對(duì)比正常小鼠和基因工程小鼠的大腦切片發(fā)現(xiàn)，酮體可降低黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元的自發(fā)放電；酮體可以通過(guò)調(diào)節(jié)囊泡性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)抑制突觸前谷氨酸的釋放，從而抑制神經(jīng)元興奮性和癲癇發(fā)作[32]。在脂肪酸水平增加并超過(guò)最大三羧酸循環(huán)功能的情況下，如在禁食或生酮治療期間，乙酰輔酶A轉(zhuǎn)向酮生成[33]。膽汁酸在動(dòng)物體內(nèi)可以乳化脂肪，擴(kuò)大與脂肪酶的接觸面積，促進(jìn)脂肪水解生成脂肪酸等代謝產(chǎn)物，從而間接提高酮體的生成[34]。

綜上所述，本研究通過(guò)斑馬魚模型快速評(píng)價(jià)了天麻的抗癲癇作用，利用TCMIP平臺(tái)探究了天麻抗癲癇的潛在作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)天麻中的天麻素、天麻醚苷、谷甾醇、棕櫚酸、西托糖苷可能通過(guò)作用于NCOA1、NR3C1、ESR1、GABRA1等25個(gè)核心靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的抑制與興奮的平衡、維持神經(jīng)元細(xì)胞的正常電生理活動(dòng)并參與酮體生成，從而發(fā)揮抗癲癇作用，體現(xiàn)了中藥治療疾病整體性、多靶點(diǎn)、網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，并為癲癇的防治提供了理論依據(jù)。

志謝：山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供斑馬魚支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Antiepileptic effect and potential mechanism ofbased on zebrafish model and integrated pharmacology of traditional Chinese medicine

PEI Wen-qiang1, SHAN Yi1, ZHANG You-gang1, 2, JIA Xian-hui1, WANG Hai-yang1, WANG Xiao-jing1, TIAN Qing-ping2, HAN Li-wen1, YAO Qing-qiang1

1. School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 256200, China 2. School of Pharmacy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

To explore the key components and potential mechanism of antiepileptic effect of Tianma () by using zebrafish model and TCMIP.AB zebrafish larva that have grown healthily to 72 h are used as experimental animals. They were treated by aminophylline to establish epileptic models to observe the effect ofon the improvement of zebrafish’s epileptic like behavior. TCMIP was used to screen the candidate anti-epilepsy targets, the protein-protein interaction network (PPI) ofwith disease was constructed, and the network map of Chinese medicinal herbs-components-core targets-pathways-diseases was drawn. Autodock Vina software was used to dock small molecules inwith proteins.had a protective effect on aminophylline-induced epileptic model of zebrafish (< 0.05). The integrated analysis based on TCMIP v2.0 found that there were 25 core targets for anti-epilepsy of, and five key pharmacodynamic compounds included gastrodin, gastrodioside, sitosterol, palmitic acid and sitogluside might be response to the anti-epilepsy effect of. These compounds could directly act on the corresponding core target proteins, participate in the balance of neurotransmitter, maintain normal electrophysiological activities of neuron cells and affect ketone bodies formation.could significantly improve epileptiform symptoms on zebrafish model. The potential mechanism of network regulation about anti-epileptic may be related to the balance of neurotransmitters, the electrophysiological homeostasis of neuronal cells and the production of ketone bodies, which provides theoretical basis for clinical application of.

; epilepsy; zebrafish; integrative pharmacology; gastrodin; gastrodioside; sitosterol; palmitic acid; sitogluside

R285.5

A

0253 - 2670(2021)07 - 2003 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.018

2020-12-17

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2019MH037）；山東省園區(qū)產(chǎn)業(yè)提升工程項(xiàng)目（2019YQ033）；山東第一醫(yī)科大學(xué)學(xué)術(shù)提升計(jì)劃（2019LJ003）

裴文強(qiáng)（1999—），本科，研究方向?yàn)橹兴幘W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。Tel: 15098928987 E-mail: VPWQ101@163.com

韓利文（1980—），博士，副研究員，從事藥物篩選及中藥質(zhì)量控制研究。Tel: (0531)59567223 E-mail: hanliwen08@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]