人參糖蛋白對阿霉素所致心肌毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

王 蕾，董金香，羅浩明，邱智東，劉 達(dá)

? 藥理與臨床 ?

人參糖蛋白對阿霉素所致心肌毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

王 蕾，董金香，羅浩明，邱智東，劉 達(dá)*

長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117

通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討人參糖蛋白對阿霉素心臟毒性的保護(hù)作用及機(jī)制。建立SD大鼠心肌損傷模型，給予人參糖蛋白進(jìn)行干預(yù)后，檢測血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzymes-MB，CK-MB）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察大鼠心肌組織病理變化。建立心肌細(xì)胞H9c2損傷模型，采用CCK-8法檢測H9c2細(xì)胞活力；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測H9c2細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和線粒體膜電位變化；采用Western blotting法檢測H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路相關(guān)蛋白、沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類3（silent mating type information regulation 2 homolog 3，Sirt3）的表達(dá)情況。心肌損傷大鼠模型中，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，肌纖維嚴(yán)重變性，LDH和CK-MB活性顯著升高（＜0.01），SOD活性和GSH水平顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，人參糖蛋白高劑量組心肌肌束排列較為整齊，LDH和CK-MB活性顯著下降（＜0.05），GSH水平顯著升高（＜0.05），人參糖蛋白對阿霉素所致的心肌組織病理學(xué)損傷有明顯修復(fù)作用。細(xì)胞損傷模型中，模型組細(xì)胞存活率顯著下降（＜0.001），細(xì)胞周期阻滯于G1期（＜0.01），細(xì)胞凋亡顯著升高（＜0.01），ROS水平顯著升高（＜0.01），線粒體膜電位顯著下降（＜0.01），Sirt3、Caspase-3、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）、p38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，人參糖蛋白組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.05、0.01），細(xì)胞增殖周期恢復(fù)，細(xì)胞凋亡率顯著降低（＜0.05），ROS水平顯著降低（＜0.05），線粒體膜電位顯著升高（＜0.05），Sirt3、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），Bax、Cyt C、JNK、p38、ERK1/2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。人參糖蛋白能夠通過抗氧化應(yīng)激、降低線粒體膜電位、提高H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平并調(diào)控MAPK信號通路抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷。

人參糖蛋白；心臟毒性；阿霉素；氧化應(yīng)激；線粒體

阿霉素為高效廣譜的抗生素，廣泛用于治療多種癌癥[1-4]。與腎臟、肝臟和大腦相比，阿霉素對心肌的親和力更高；阿霉素會引起心肌收縮功能障礙和心力衰竭，產(chǎn)生自由基損傷心臟，極大限制了其臨床的應(yīng)用[5-6]。阿霉素誘導(dǎo)心臟的損傷與臨床心肌疾病的病理表現(xiàn)相似[7]。人參具有抗損傷、抗衰老、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[8-11]。人參中含有皂苷、多糖等活性成分，課題組前期從人參中提取了具有生物活性的人參糖蛋白[12-13]。人參糖蛋白具有改善記憶功能、治療老年癡呆、鎮(zhèn)靜、催眠等作用[14-17]，由于糖蛋白具備糖類和蛋白質(zhì)的雙重特性，其生物活性較好。以人參為代表的中藥由于其安全性和多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，在保護(hù)心肌損傷方面有著重要的作用，目前人參糖蛋白對阿霉素所致的心臟毒性作用研究尚無報(bào)道。本研究探究人參糖蛋白對阿霉素所致心臟毒性的保護(hù)作用及機(jī)制，為其抑制阿霉素誘導(dǎo)的癌癥患者心臟毒性提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（220±10）g，8周齡，購自吉林省實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量檢測中心，動物許可證號SCXK（吉）-2018-0007。動物于溫度（20±5）℃、濕度（45±10）%條件下飼養(yǎng)。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2020208）。

1.2 細(xì)胞

大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司。

1.3 藥物

人參糖蛋白由長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥劑實(shí)驗(yàn)室自制，中性碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%、酸性碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82%；相對分子質(zhì)量為8000～44 000，平均相對分子質(zhì)量為19 994，具體結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜圖參見文獻(xiàn)報(bào)道[10-15]。

鹽酸阿霉素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，批號D8740）購自北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉注射液（批號1812380721）購自辰欣藥業(yè)股份有限公司；卡托普利片（25 mg/片，批號63181201）購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司。

1.4 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（批號81220286）、胎牛血清（批號42G2095K）購自美國Gibco公司；磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline，PBS）溶液（批號AF29485475）、胰酶（批號J200014）、青霉素鏈酶素雙抗（批號J190005）購自美國Hyclone公司；CCK8試劑盒（批號AR1199）購自博士德生物工程有限公司；臺盼蘭（批號20190520）、線粒體膜電位檢測試劑盒（批號M8650）、Hoschst 33342染色液（批號C0031）購自北京索萊寶科技有限公司；碘化丙啶（批號B07T00102）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit（批號9312842）購自BD PharmingenTM；β-actin抗體（批號10011066）、Caspase-3抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號00080083）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號00080266）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）抗體（批號00047881）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）抗體（批號10010983）、p38抗體（批號00076414）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）抗體（批號10009232）、沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類3（silent mating type information regulation 2 homolog 3，Sirt3）抗體（批號00048945）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體（批號20000242）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（批號20000217）購自美國Proteintech公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定測試盒（批號20200616）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（批號20200617）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒（批號20200619）購自南京建成生物有限公司；肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzymes-MB，CK-MB）酶免試劑盒（批號202006）購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；BCA蛋白測定試劑盒（批號080719191113）、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號123119200922）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號C0105S）購自上海碧云天有限公司。

1.5 儀器

SpectraMax Paradigm酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；1645050蛋白質(zhì)電泳儀（美國BIO-RAD公司）；Forma? 3 CO2恒溫培養(yǎng)箱、1300 series A2生物安全柜、Heraeus? Megafuge? 8離心機(jī)、iBright FL1000多功能凝膠成像系統(tǒng)、Countess? II FL全自動細(xì)胞成像系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Cytoflex FCM流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）；MK200-2干濕恒溫器（長春綠谷生物科技有限公司）；BX63熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥

按照文獻(xiàn)方法[13]，將大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組及人參糖蛋白低、高劑量（255、510 mg/kg）組和卡托普利（10 mg/kg）組，每組10只。采用ip阿霉素法建立大鼠心肌損傷模型[18]，對照組ip氯化鈉注射液（1 mL/kg），其余各組ip等體積阿霉素（2.5 mg/kg，阿霉素溶于生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的溶液），3次/周，連續(xù)2周。人參糖蛋白、卡托普利分別溶于生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為150、10 mg/mL的溶液。造模同時，對照組和模型組尾iv氯化鈉注射液（2.5 mL/kg），各給藥組尾iv相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)21 d。

2.2 人參糖蛋白對心肌損傷大鼠血清生化指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

大鼠ip水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，常溫靜置30～60 min，4 ℃、5000 r/min離心5 min，按照試劑盒說明書檢測血清中生化指標(biāo)（LDH、CK-MB）和氧化應(yīng)激指標(biāo)（GSH、SOD）。

2.3 人參糖蛋白對心肌損傷大鼠心肌組織病理變化的影響

大鼠iv巴比妥（150 mg/kg）安樂死，取心肌組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片（厚5 μm），脫蠟后置蘇木素染液中染色3 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，自來水中返藍(lán)15 min；再將切片放入伊紅染液中繼續(xù)染色1 min，用自來水沖洗殘留的染液。將切片進(jìn)行脫水和透明處理，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置對照組、模型組和不同質(zhì)量濃度（50、100、200 μg/mL）人參糖蛋白給藥組[12]。模型組和各給藥組加入0.58 μg/mL阿霉素[19]，各給藥組另加入相應(yīng)藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。

2.5 人參糖蛋白對細(xì)胞活力的影響

取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，按“2.4”項(xiàng)下方法處理。每孔中加入10 μL CCK-8溶液，孵育1～4 h，于450 nm處測定吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.6 人參糖蛋白對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞，以2×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“2.4”項(xiàng)下方法處理。

收集細(xì)胞懸液，加入70%乙醇4 ℃固定過夜，用PBS洗滌3次，加入1 mL碘化丙啶（PI）染料，混勻后避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)樣檢測，用ModFit軟件對細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

收集細(xì)胞懸液，加入200 μL結(jié)合緩沖液、5 μL膜聯(lián)蛋白V和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)樣檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.7 人參糖蛋白對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞，以2×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，按“2.4”項(xiàng)下方法處理。收集細(xì)胞懸液，加入100 μL DCFH-DA探針（10 μmol/L），孵育20 min，用無血清的DMED培養(yǎng)基清洗3次，流式細(xì)胞儀進(jìn)樣檢測。

2.8 人參糖蛋白對細(xì)胞線粒體膜電位的影響

取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞，以2×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，按“2.4”項(xiàng)下方法處理。收集細(xì)胞懸液，加入0.5 mL JC-1染色工作液，孵育20 min，4 ℃、1400 r/min離心3 min，棄上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，用JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)樣檢測。

2.9 人參糖蛋白對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞，以2×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，按“2.4”項(xiàng)下方法處理。3000 r/min離心5 min，棄上清，加入RAPI裂解液，裂解4 h；12 000 r/min離心30 min，吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，加入上樣緩沖液，95 ℃金屬浴10 min。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入β-actin（1∶5000）、Bax（1∶2000）、Bcl-2（1∶1000）、Caspase-3（1∶1000）、Cyt C（1∶1000）、JNK（1∶3000）、p38（1∶500）、ERK1/2（1∶2000）、Sirt3（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠抗體，孵育1.5 h，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，采用多功能凝膠成像儀顯影。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 人參糖蛋白對心肌損傷大鼠血清生化指標(biāo)的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中CK-MB和LDH活性均顯著升高（＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，人參糖蛋白高劑量組和卡托普利組CK-MB和LDH活性均顯著下降（＜0.05、0.01），表明人參糖蛋白可以減輕阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心臟毒性。

3.2 人參糖蛋白對心肌損傷大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中SOD活性和GSH水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，人參糖蛋白高劑量組GSH水平顯著升高（＜0.05），SOD活性呈升高趨勢。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 人參糖蛋白對心肌損傷大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響()

3.3 人參糖蛋白對大鼠心肌組織病理學(xué)的影響

如圖3所示，對照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，心肌肌束排列整齊，無明顯組織病理學(xué)損傷；模型組心肌細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，心肌肌束排列明顯紊亂，產(chǎn)生炎性細(xì)胞浸潤和核溶解；與模型組比較，人參糖蛋白低劑量組沒有明顯變化，人參糖蛋白高劑量組和卡托普利組對阿霉素所致的心肌組織病理學(xué)損傷有明顯改善作用。

圖3 人參糖蛋白對心肌損傷大鼠心肌組織病理變化的影響(HE, ×200)

3.4 人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活性的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞存活率明顯降低（＜0.001），提示造模成功。與模型組比較，人參糖蛋白組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性。

3.5 人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞周期的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著升高（＜0.01），S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯減少（＜0.01），表明阿霉素使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制H9c2細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，影響DNA正常復(fù)制，從而抑制H9c2細(xì)胞增殖。與模型組比較，人參糖蛋白中、高劑量組G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著降低（＜0.01），S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)顯著升高（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

圖4 人參糖蛋白對阿霉素?fù)p傷的H9c2細(xì)胞活性的影響()

3.6 人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率（早期凋亡與中晚期凋亡之和）明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，人參糖蛋白組細(xì)胞凋亡率顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

3.7 人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組ROS熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（＜0.01）；與模型組比較，人參糖蛋白高劑量組ROS熒光強(qiáng)度顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

圖5 人參糖蛋白對阿霉素?fù)p傷的H9c2細(xì)胞周期的影響

圖6 人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響()

圖7 人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響()

3.8 人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞線粒體功能的影響

線粒體膜電位是衡量線粒體功能的主要指標(biāo)，正常細(xì)胞的膜電位正常時，JC-1通過線粒體膜極性進(jìn)入線粒體內(nèi)，并因濃度升高而形成發(fā)射紅色熒光的多聚體；凋亡細(xì)胞的線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式。如圖8所示，與對照組比較，模型組線粒體膜去極化的細(xì)胞比例增多，線粒體膜電位顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，人參糖蛋白高劑量組線粒體膜完整細(xì)胞比例增多，紅/綠熒光相對強(qiáng)度逐漸升高，線粒體膜電位顯著升高（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

3.9 人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路相關(guān)蛋白和Sirt3蛋白表達(dá)的影響

如圖9所示，與對照組比較，模型組Caspase-3、Bcl-2、Sirt3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），Bax、Cyt C、JNK、p38、ERK1/2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。與模型組比較，人參糖蛋白高劑量組Caspase-3、Bcl-2、Sirt3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），Bax、Cyt C、JNK、p38、ERK1/2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

圖8 人參糖蛋白對阿霉素?fù)p傷的H9c2細(xì)胞線粒體膜電位的影響()

圖9 人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白、MAPK通路相關(guān)蛋白和Sirt3蛋白表達(dá)的影響()

4 討論

人參具有降低心肌梗死面積、調(diào)節(jié)血液循環(huán)、調(diào)血脂等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的預(yù)防。阿霉素可誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡和自噬，人參皂苷Rb1可能通過抑制阿霉素誘導(dǎo)的自噬，從而保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性；從人參中提取到具有保護(hù)心臟作用的酸性多糖組分，其心臟保護(hù)作用與激活受體介導(dǎo)的再灌注損傷挽救激酶（reperfusion injury salvage kinase，RISK）/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）/一氧化氮（nitric oxide，NO）通路、調(diào)節(jié)線粒體功能和代謝有關(guān)[20-21]。因此，本研究探究了人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷的作用及機(jī)制。

阿霉素是治療腫瘤的常用藥物[22]，其對心臟的毒性限制了臨床應(yīng)用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素造成的心肌損傷與氧化應(yīng)激[24]、線粒體功能障礙[25]、細(xì)胞凋亡[26]、Ca2+-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶活性降低、DNA損傷[27]等相關(guān)。氧化應(yīng)激損傷在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)在抗氧化系統(tǒng)以降低ROS水平，提高細(xì)胞存活率，GSH可催化過氧化氫等過氧化物還原，SOD可催化O2?還原為過氧化氫。本研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷大鼠血清中CK-MB與LDH活性升高，引起心肌損傷，這可能是由于阿霉素引起心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致CK-MB從心肌細(xì)胞質(zhì)滲漏到血液中；人參糖蛋白對阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，可顯著降低LDH和CK-MB活性，顯著增加GSH水平。

線粒體是阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的主要靶標(biāo)，阿霉素進(jìn)入細(xì)胞后在線粒體中積累并破壞線粒體電子鏈，ROS生成增加，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，促進(jìn)凋亡蛋白Cyt C表達(dá)，激活Caspase-3，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，人參糖蛋白可恢復(fù)阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞線粒體膜電位，降低ROS水平，提高細(xì)胞存活率，抑制H9c2細(xì)胞的凋亡途徑，從而有效緩解阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性。

激活Sirtuins可保護(hù)心臟免受阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響[28]。Sirt3是Sirtuin家族在線粒體中的主要脫乙酰基酶，具有清除ROS和提高抗氧化酶活性的能力，可通過乙?；图せ铍娮觽鬟f鏈負(fù)向調(diào)控ROS的產(chǎn)生，Sirt3可通過激活多種防御機(jī)制抑制心肌細(xì)胞凋亡[29]。本研究結(jié)果顯示，阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞Sirt3蛋白表達(dá)水平降低，ROS水平升高；人參糖蛋白可上調(diào)Sirt3蛋白表達(dá)水平，降低ROS水平。MAPKs在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，ERK1/2、JNK和p38參與阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的響應(yīng)[30]。本研究結(jié)果顯示，人參糖蛋白可能通過下調(diào)ERK1/2、JNK和p38來緩解阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性，保護(hù)心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，人參糖蛋白能上調(diào)Sirt3蛋白表達(dá)水平、減少ROS產(chǎn)生、恢復(fù)線粒體膜電位、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平、減少Cyt C釋放以及Caspase-3裂解、抑制氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)MAPK信號通路，從而有效改善阿霉素所致的心臟毒性。本研究為減少阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡、提高心臟功能和改善心血管病的藥物開發(fā)提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect and mechanism of ginseng glycoproteins on cardiotoxicity caused by adriamycin

WANG Lei, DONG Jin-xiang, LUO Hao-ming, QIU Zhi-dong, LIU Da

School of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China

andexperiments were conducted to investigate the protective effect and mechanism of ginseng glycoproteins on adriamycin-induced cardiotoxicity.SD rats myocardial injury model was established. After intervention with ginseng glycoprotein, activities of lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase isoenzymes-MB ??(CK-MB), and superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) levels in serum were detected; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of rat myocardial tissue. H9c2 injury model of cardiomyocytes was established, and viability of H9c2 cells was detected by CCK-8 method; H9c2 cells cycle, apoptosis, reactive oxygen species (ROS) levels and mitochondrial membrane potential changes in mitochondrial membrane potential were detected by flow cytometry; Western blotting was used to detect expressions of apoptosis-related proteins, mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway related proteins and silent information regulator 2 related enzymes 3 (Sirt3) in H9c2 cells.In myocardial injury rats model, the myocardial fiber arrangement of model group was disordered, the muscle fiber was severely degenerated, the activities of LDH and CK-MB were significantly increased (< 0.01), and the SOD activity and GSH level were significantly decreased (< 0.05, 0.01); Compared with model group, the myocardial muscle bundles in high-dose ginseng glycoprotein group were arranged more neatly, activities of LDH and CK-MB were significantly decreased (< 0.05), and level of GSH was significantly increased (< 0.05). The pathological damage of myocardial tissue caused by adriamycin had obvious repairing effect. In cell injury model, cell viability of model group was significantly decreased (< 0.001), cell cycle was arrested in G1phase (< 0.01), apoptosis was significantly increased (< 0.01), and level of ROS was significantly increased (< 0.01), mitochondrial membrane potential was significantly decreased (< 0.01), expressions of Sirt3, Caspase-3, B cell lymphoma-2 (Bcl-2) were significantly decreased (< 0.01), expressions of Bcl-2 associated X protein (Bax), cytochrome C (Cyt C), c-Jun-terminal kinase (JNK), p38, extracellular regulated protein kinases 1/2 (ERK1/2) were significantly increased (< 0.05, 0.01); Compared with model group, cell viability of ginseng glycoprotein group was significantly increased (< 0.05, 0.01), cell proliferation cycle was restored, and apoptosis rate was significantly reduced (< 0.05), ROS level was significantly reduced (< 0.05), and mitochondrial membrane potential was significantly increased (< 0.05), expressions of Sirt3, Caspase-3 and Bcl-2 in ginseng glycoprotein group were significantly increased (< 0.05), expressions of Bax, Cyt C, JNK, p38, ERK1/2 were significantly reduced (< 0.05).Ginseng glycoprotein can prevent oxidative stress, reduce mitochondrial membrane potential, increase ROS level in H9c2 cells, and regulate MAPK signaling pathway to inhibit cell apoptosis, thereby protecting adriamycin-induced myocardial injury.

ginseng glycoprotein; cardiotoxicity; adriamycin; oxidative stress; mitochondria

R285.5

A

0253 - 2670(2021)07 - 1965 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.013

2020-12-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81803680）；吉林省科技發(fā)展項(xiàng)目（20170309005YY）；吉林省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（2020041）

王 蕾（1995—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)。E-mail: 597790201@qq.com

劉 達(dá)，男，副教授，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。Tel: 18743010987 E-mail: liuda_1986@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]