馬來穿山甲源嗜水氣單胞菌亞種的分離鑒定及生物學特性分析

杜雪晴，古河祥，薩家祺，吳亞江，侯方暉，肖嘉杰，翟俊瓊，陳 武，鄒潔建

（1.廣州動物園，廣州市野生動物研究中心，廣東廣州 510070；2.廣東省野生動物救護中心，廣東廣州 510520）

嗜水氣單胞菌屬于弧菌科氣單胞菌屬，可從自然水體、土壤中被分離檢測到，是目前普遍存在的一種人、畜、水生動物共患病原菌[1]。在一定條件下，該菌還能感染魚類、鳥類、爬行類和兩棲類動物，致使感染動物出現(xiàn)不同程度的腹瀉、敗血癥、肝臟大、皮膚潰爛等癥狀[2-4]，因此做好該病的診斷，了解感染菌株的致病性及耐藥情況并及時治療，是防治的重要途徑。

2019 年3 月，救護轉移至廣東省野生動物救護中心的1 只馬來穿山甲腿部肌肉出現(xiàn)感染潰爛，通過無菌操作取腿部潰爛組織進行細菌分離培養(yǎng)，得到1 株優(yōu)勢菌。經(jīng)形態(tài)特性、革蘭氏染色及16S rRNA 和gyrB基因序列進化樹分析鑒定，證實其為嗜水氣單胞菌亞種Aeromonas hydrophilasubsp.Dhakensis（縮寫Aeromonas dhakensis）。本研究對該病原菌的生物學特性、遺傳進化特征、毒力因子及耐藥情況進行研究，以期為嗜水氣單胞菌的流行病學調查及其感染的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

血瓊脂培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基、PCA 平板技術瓊脂、革蘭氏染色試劑盒、細菌基因組DNA 提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix，均購自廣州維寧生物科技有限公司；18 種標準藥敏紙片，由溫州市康泰生物科技有限公司生產(chǎn)；細菌16S rRNA、gyrB基因、耐藥基因、毒力基因的引物合成和測序，均由廣州睿博興科生物技術公司完成；42 只SPF 昆明小鼠（6 周齡），購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，體質量（30±5）g。

1.2 細菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

無菌條件下采集穿山甲腿部潰爛組織樣品，浸液接種于血瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，觀察菌落形態(tài)特征，純化至單個菌落；用接種環(huán)挑取平板上單個菌落，接種于LB 液體培養(yǎng)基；將純化的菌液接種在血瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體染色特性及形態(tài)。

1.3 藥敏試驗

采用紙片擴散法（K-B 法），將純培養(yǎng)的細菌培養(yǎng)液用LB 液體培養(yǎng)基稀釋至0.5 麥氏比濁管濃度（此時菌液濃度為1.5×108CFU/mL）并均勻涂布于MH 培養(yǎng)基表面；待表面菌液干燥后使用無菌鑷子夾取18 種標準藥敏紙片緊貼于MH 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；測量各抑菌環(huán)直徑，依據(jù)說明書判斷標準判定分離菌株對所用藥物的敏感程度。藥敏紙片包括：青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢曲松、頭孢克肟、頭孢吡肟、頭孢哌酮舒巴坦、丁胺卡那、鏈霉素、慶大霉素、阿奇霉素、氯霉素、利福平、諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星及左氧氟沙星。

1.4 16S rRNA 和gyrB 基因擴增及遺傳進化分析

取培養(yǎng)24 h 的菌液2 mL，采用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取分離菌DNA，作為PCR 反應模板。參照文獻[2]合成細菌16S rRNA 基因通用引物，參照文獻[5]合成gyrB基因擴增引物，引物序列見表1。PCR 擴增體系：F、R 引物各1.0 μL（1.0 μmol/L），2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，Nuclease-free Water 8.5 μL，DNA 模板2.0 μL，合計總體積25.0 μL。PCR 反應程序：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，Tm（退火溫度）30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃，7 min。PCR 產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴增陽性產(chǎn)物送廣州睿博興科生物技術公司測序，采用Lasergene 7.0軟件進行序列拼接。

將菌株的16S rRNA 和gyrB基因序列與GenBank 中已報道的核酸序列進行在線BLAST分析，調出與其同源性較高的核酸序列，并參照LPSN（the list of prokaryotic names with standing in nomenclature）下載氣單胞菌屬相關模式菌株的16S rRNA 基因序列及同種不同株系的16S rRNA和gyrB基因序列。使用Mega7.0 軟件對上述序列進行比對，以Escherichia coli和Vibrio cholerae為外群，采用臨接近法構建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析進行置信度檢測，自舉次數(shù)1 000 次，以估算其內(nèi)分支的支持率。

1.5 毒力試驗

利用平板計數(shù)法測定24 h肉湯培養(yǎng)菌液濃度，根據(jù)預試驗結果，將菌液配制成6 種濃度梯度；分別將6 種濃度的菌液各腹腔接種SPF 小鼠6只（0.2 mL/只），另設陰性對照組小鼠6 只，分別腹腔接種生理鹽水0.2 mL；攻菌組和對照組小鼠飼養(yǎng)條件相同，隔離飼養(yǎng)；感染細菌后連續(xù)觀察7 d，并對小鼠死亡情況進行記錄；根據(jù)小鼠死亡情況，采用Reed-Muench 法計算菌株對SPF 昆明小鼠的半數(shù)致死量（LD50）。對死亡小鼠立即解剖，無菌采集臟器，分離培養(yǎng)并鑒定。

1.6 耐藥基因及毒力基因檢測

采用PCR 方法對分離菌株6 種毒力基因、19 種耐藥基因進行檢測[6-8]，各引物序列見表1。PCR 擴增體系：F、R 引物各1.0 μL（1.0 μmol/L），2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，Nuclease-free Water 8.5 μL，DNA 模板2.0 μL，合計總體積25.0 μL。PCR 反應程序：95 ℃ 4 min；95 ℃30 s，Tm 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃，7 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陽性擴增樣品送測序公司測序后，登陸GenBank進行BLAST 分析。

表1 PCR 擴增相關基因引物信息

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

該菌在血瓊脂平板上形成直徑1～2 mm、表面光滑、圓形凸起、灰白色的菌落（圖1）。挑取單個純培養(yǎng)菌落進行涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢。結果（圖2）顯示，該菌為革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓，單個或成對排列。

圖1 分離菌血平板菌落

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢結果（10×100）

2.2 藥敏試驗

由表2 可知，該菌株對青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛、氯霉素、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、林可霉素耐藥；對鏈霉素、紅霉素以及利福平等中度敏感，對頭孢曲松、頭孢克肟、慶大霉素和氧氟沙星等敏感。

表2 分離菌藥敏試驗結果

2.3 16S rRNA 及gyrB 基因擴增及遺傳進化分析

分離菌株（命名MJA12）16S rRNA 和gyrB基因PCR 擴增結果見圖3。經(jīng)測序、校正后分別獲得1 385 bp 和1 003 bp 的序列。登錄NCBI 進行BLAST 比對分析，MJA12 菌株16S rRNA 序列與GenBank 中已報道的多株氣單胞菌序列高度同源，與登錄號為MK958566.1、LC420123.1、MG818965.1、MF776531.1 和MT368027.1 等序列相似性達100%；MJA12 菌株gyrB基因與GenBank 中已報道的多株嗜水氣單胞菌序列高度同源，與登錄號為LC003063.1 序列相似性達100%，與登錄號為MT372057.1、JN711807.1、MT371989.1和MK572686.1 等序列相似性達到99%。

圖3 菌株MJA12 的16S rRNA 和gyrB 基因PCR 電泳結果

采用NJ 法，分別基于16S rRNA 和gyrB基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。本試驗分離的MJA12 菌株16S rRNA 與豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、嗜水氣單胞菌亞種（Aeromonas dhakensis）及腸棕氣單胞菌（Aeromonas enteropelogenes）聚為同一分支（圖4）。gyrB基因主要與嗜水氣單胞菌亞種（Aeromonas dhakensis）聚為同一分支（圖5）。依據(jù)16S rRNA 和gyrB基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹綜合分析，MJA12 菌株與嗜水氣單胞菌亞種（Aeromonas dhakensis）親緣關系最近，因此鑒定為嗜水氣單胞菌亞種（Aeromonas dhakensis）。

2.4 分離菌株對小鼠致病性

接種MJA12 菌株的小鼠在接種后出現(xiàn)精神沉郁、飲食欲降低、站立不穩(wěn)等癥狀。接種108CFU/mL 濃度菌液組小鼠在12 h 內(nèi)相繼死亡，接種107CFU/mL 濃度菌液組小鼠在24 h 內(nèi)相繼死亡，其余各組小鼠感染劑量與7 d 連續(xù)觀察情況見表3。死亡小鼠主要表現(xiàn)為腹膜出血、肝臟大、出血性腸炎（圖6）。取小鼠肺臟、肝臟組織進行細菌分離鑒定，可重新檢測到接種菌株。試驗期間，未接種分離菌的對照組小鼠健康狀況良好。采用Reed-Muench 法計算得知，菌株MJA12 的LD50為3.75×106CFU/mL。

圖4 分離菌16S rRNA 序列系統(tǒng)進化樹（NJ 樹）分析結果

圖5 分離菌gyrB 基因序列系統(tǒng)進化樹（NJ 樹）分析結果

表3 分離菌對小鼠致病性試驗結果

圖6 人工感染小鼠試驗結果

2.5 分離菌毒力基因檢測

毒力基因PCR 檢測結果見圖7。對與目的基因大小一致的PCR 陽性擴增產(chǎn)物測序分析，并將序列登錄NCBI 進行BLAST 分析，共檢測出4種毒力基因aerA（290 bp）、hlyA（584 bp）、alt（482 bp）、act（249 bp）；引物擴增片段分別與NCBI 中基因序列登錄號為AF485771.1、JN602736.1、L77573.1 以及JX489371.1 的嗜水氣單胞菌4 種毒力基因高度同源，表明菌株MJA12具有較強的致病性。

圖7 分離菌毒力基因PCR 擴增電泳圖

2.6 分離菌耐藥基因檢測

耐藥基因PCR 擴增結果見圖8。對與目的基因大小一致的4 種耐藥基因PCR 產(chǎn)物測序分析，共發(fā)現(xiàn)4 種耐藥基因tem（860 bp）、aac(3)-II（237 bp）、flor（1 215 bp）和sul2（191 bp）；引物擴增片段分別與NCBI 中登錄號 為LC310937.1、KC958582.1、MT1513801 和CP055262.1 的嗜水氣單胞菌4 種耐藥基因核苷酸序列高度同源，表明分離菌MJA12 攜帶4 種耐藥基因tem、aac(3)-II、flor、sul2。

圖8 分離菌耐藥基因PCR 擴增電泳結果

3 討論

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的水與土壤中，為革蘭氏陰性短桿菌，極端單鞭毛，沒有芽孢和莢膜，是一種條件致病菌。人和動物感染嗜水氣單胞菌后可導致皮膚潰爛、傷口化膿、腹瀉和急性出血性敗血癥等[9-10]。本研究從救護的馬來穿山甲腿部潰爛組織樣品中分離出1 株嗜水氣單胞菌MJA12。該菌在瓊脂平板上形成圓形凸起、表面光滑、灰白色菌落，與以往研究報道[7]一致。16S rRNA 序列分析是細菌分子鑒定的重要依據(jù)，但由于其在細菌菌種鑒定上存在局限性，有必要結合其他保守的管家基因進行補充和驗證[11]。對于眾多管家基因，gyrB基因在氣單胞菌序列分析中能揭示較高的堿基差異，可以很好區(qū)分屬內(nèi)菌種[12]。本研究利用16S rRNA 和gyrB基因序列對穿山甲源嗜水氣單胞菌MJA12 進行了分子鑒定，結果顯示gyrB基因序列能將16S rRNA 序列一致的不同菌株較好地分開，結合2 個基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可較準確地對嗜水氣單胞菌進行分子鑒定，確定菌株MJA12 為嗜水氣單胞菌亞種（Aeromonas dhakensis）。從圖5 建立的菌株進化樹可以看出，分離菌株MJA12 與LC003063.1（泰國，2009）及MT372050.1、MT372057.1、MT372059.1（馬來西亞，2019）關系最近，根據(jù)此批非法走私馬來穿山甲的溯源情況，推測本次分離的MJA12 菌株可能從馬來西亞傳入我國。相關研究[13-15]表明，與氣單胞菌屬的其他菌種相比，嗜水氣單胞菌亞種（Aeromonas dhakensis）在人和小鼠細胞系中具有更高的細胞毒性，在臨床上因細菌膿毒性引起的死亡率更高。

嗜水氣單胞菌之所以能導致人與動物發(fā)生炎癥性疾病，是因為該菌攜帶毒力基因并分泌多種毒力因子，aerA、rtxA、hlyA、alt、act和epa是嗜水氣單胞菌的重要毒力基因[16]。aerA基因表達氣溶素（aerolysin）。氣溶素對宿主細胞具有溶血性、細胞毒性和腸毒性，aerA基因缺失的嗜水氣單胞菌毒力減弱[6]。rtxA基因表達的重復毒素A，其能導致宿主細胞凋亡[17]。hlyA基因表達的溶血素（hemolysin），可對宿主細胞構成細胞毒性損害；劉杰等[18]將hly基因作為致病性嗜水氣單胞菌的鑒定標準。alt基因表達的熱不穩(wěn)定細胞興奮性腸毒素，act基因表達的細胞毒性腸毒素，均具有腸毒性[16]。epa基因表達的嗜水氣單胞菌重要的胞外蛋白酶，能直接作用于宿主相關器官組織，造成靶器官組織溶解或壞死，以利于病原菌入侵宿主和攝取營養(yǎng)物質[19]。細菌所攜帶的毒力因子與其致病性緊密相關。此菌株人工感染小鼠使其出現(xiàn)腹膜出血、出血性腸炎、急性敗血癥死亡，與檢測出的4種毒力基因aerA、hlyA、alt、act致病作用相符。牛志偉等[19]把aerA、hlyA、act基因歸類為可引起宿主死亡的主要毒力基因，陳婷婷等[20]研究也發(fā)現(xiàn)攜帶aerA和hlyA基因的嗜水氣單胞菌致病性顯著增強。這表明從患病馬來穿山甲腿部肌肉組織分離的嗜水氣單胞菌亞種（Aeromonas dhakensis）具有較強的致病性。

嗜水氣單胞菌耐藥菌株表現(xiàn)出耐藥譜廣、耐藥率高的特點。本試驗結果顯示，分離菌對β-內(nèi)酰胺類的青霉素、阿莫西林，頭孢類的頭孢氨芐、頭孢克洛，及氯霉素、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、林可霉素等耐藥，對頭孢曲松、頭孢吡肟等藥物敏感，與陳婷婷[20]的調查結果較相似。嗜水氣單胞菌的耐藥機制包括獲得性耐藥、主動外排泵作用、細胞膜滲透性改變等[9]。有研究報道，嗜水氣單胞菌的細胞壁最外層由疏水性脂多糖形成，阻止了一些未修飾青霉素的擴散，對青霉素有固有抗性[21]，且通過質粒、轉座子及整合子等介導基因水平轉移以及染色體突變使其獲得新的耐藥基因[9，22]。此分離菌中檢測到β-內(nèi)酰胺酶基因tem、乙酰轉移酶基因aac(3)-II、氯霉素基因flor和磺胺基因sul2共4種獲得性耐藥基因，綜合藥敏試驗結果分析，該菌耐藥表型和耐藥基因型相符。該分離菌除對青霉素的固有耐藥性外，還可能通過質粒和整合子等可移動原件從環(huán)境中其他耐藥菌獲得了抗性基因tem、aac(3)-II、flor和sul2。

馬來穿山甲被救護時腿部潰爛，與其他感染嗜水氣單胞菌的動物癥狀一致[2，23]，使用藥敏試驗推薦的抗菌藥物治療后能較好控制感染，說明分離菌MJA12 為馬來穿山甲腿部潰爛的病原。對于嗜水氣單胞菌亞種（Aeromonas dhakensis）感染的防治不宜使用青霉素、磺胺類藥物，在實際生產(chǎn)中應使用敏感藥物進行治療，且輪換使用，可降低耐藥菌株的發(fā)生概率。