基于非洲豬瘟病毒標準物質的熒光PCR 檢測試劑盒初步評價

（寧夏動物疾病預防控制中心，寧夏銀川 750001）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）引起家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，發(fā)病過程短，死亡率可高達100%，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。因此，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報動物疫病，我國將其列為重點防范的一類動物疫病[1]。

目前，ASFV 的實驗室檢測方法主要有PCR、熒光PCR、ELISA 等。相較于ELISA 方法，熒光PCR 方法在豬感染早期即可檢測到ASFV 核酸，具有快速、準確、敏感性高等優(yōu)點，是監(jiān)測和早期診斷ASF 的重要手段，同時用熒光PCR 方法檢測ASFV 也是OIE 認可的方法。

2018 年8 月3 日我國首例ASF 疫情被確診以來，各種ASFV 檢測試劑盒在我國ASF 防控中發(fā)揮了重要作用，但同時如何選用最合適的試劑盒開展防控工作，成為各獸醫(yī)實驗室面臨的一項重要工作。為探究ASFV 標準物質作為試劑盒評價體系的可行性，本研究使用ASFVP72基因核酸標準物質作為評價標準，對市場上5 種主流品牌ASFV熒光PCR 檢測試劑盒的檢測性能進行對比分析，以期為各實驗室的ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

ASFVP72基因核酸標準物質（質粒濃度5.9×103拷貝/μL），由中國動物疫病預防控制中心提供。5 個廠家（A、B、C、D、E，均為國產）生產的ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒信息見表1。無菌無核酶水，購自Promega 公司；一次性移液器吸頭，購自Axygen 公司。

表1 5 個廠家生產的ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒信息

1.2 儀器和設備

單道微量移液器和多道微量移液器，購自Eppendorf 公司；iQ5 熒光定量PCR 儀，購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

將ASFVP72基因質粒標準物質進行10 倍倍比稀釋（5.9×103～5.9×10-5拷貝/μL），設置3 個平行對照，使用5 個廠家的ASFV 檢測試劑盒，嚴格按照試劑盒使用說明書，對不同濃度倍比稀釋的標準物質進行檢測，比較不同試劑盒之間的反應時長，并通過制作標準曲線分析不同試劑盒的敏感性和重復性。

2 結果

2.1 對照檢測情況

本研究中，各廠家試劑盒自帶的陰、陽性對照反應結果均判定為試驗結果成立，表明該試劑盒的檢測結果符合產品說明書要求。

2.2 反應時長比較

各試劑盒的實際反應耗時均高于理論反應耗時，其中D 廠家試劑盒差異最大，C 廠家試劑盒差異最小。B 廠家試劑盒理論反應耗時和實際反應耗時最短，A 廠家理論與實際反應耗時均最長。比較結果見表2。

表2 5 種廠家ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒反應時長比較

2.3 擴增曲線及標準曲線分析

各廠家試劑盒擴增曲線均具有明顯的對數(shù)增長期，最低檢測限均為5.9×10-1拷貝/μL，A、B、C、D 廠家試劑盒的線性關系R2＞0.98，其中C 試劑盒最優(yōu)（R2=0.994）。5 個廠家的ASFV 檢測試劑盒擴增曲線及標準曲線見圖1～5。

3 分析與討論

ASF 發(fā)病率、死亡率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。ASFV 抵抗力頑強，在組織中可保持長時間感染，并且目前無有效的ASF 疫苗和治療方法[2]。ASF最重要的防控措施是監(jiān)測、早期診斷并及時消滅傳染源，而各種實驗室檢測方法為監(jiān)測和及時診斷疫情提供了重要依據(jù)[3]。

圖1 A 試劑擴增曲線及檢測標準曲線

圖2 B 試劑擴增曲線及檢測標準曲線

圖3 C 試劑擴增曲線及檢測標準曲線

圖4 D 試劑擴增曲線及檢測標準曲線

圖5 E 試劑擴增曲線及檢測標準曲線

本試驗使用ASFV 標準物質作為評價體系，對在售的5 個廠家生產的商品化AFSV 熒光PCR檢測試劑盒進行了對比，結果表明5 個試劑盒都有良好的重復性，可用于ASFV 核酸檢測。試驗中，C 試劑盒檢出Ct 值較其他試劑盒提前1.03 個循環(huán)且離散度小，所需反應時間亦較少。如果檢測樣品來源于病死生豬，并且有較高的病毒含量，那么5種試劑盒檢測結果均無太大差異；若是無臨床癥狀生豬或病毒含量低的樣本，可以綜合考慮選擇離散度小、所需反應時間少的試劑盒。

標準物質作為一種“量具”，具有實驗室校準、計量溯源性建立、其他材料賦值、測量方法/程序確認、實驗室內或實驗室間質量控制等用途[4]。已有研究認為，使用ASFV 核酸標準物質對不同ASFV 核酸檢測試劑盒進行驗證評價是一種有效的實驗室內部質量控制手段。喬彩霞等[5]體外合成了ASFVVP72全基因能力驗證用質控樣品，可有效評價各級獸醫(yī)實驗室的檢測能力。原霖等[4]基于含P72基因核酸序列的質粒pUC19-P72 研發(fā)的ASFV 標準物質具有均一性良好、量值準確度高、產品質量穩(wěn)定、與動物樣本互通性良好等優(yōu)點。

本試驗結果也表明，各生產廠家使用P72基因作為靶基因研制的ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒可使用ASFV 標準物質作為評價體系，來評判ASFV 核酸檢測試劑盒的反應時間、靈敏度、可重復性等性能。