非洲豬瘟病毒核酸定性檢測方法比對

王 晶，孫金紅，薛曉晶

（1.中檢科（北京）測試技術(shù)有限公司，北京 100123；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心，北京 100123）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員[1]，對家豬和野豬具有高度傳染性和致死性[2]，可引發(fā)非洲豬瘟（African swine fever，ASF）疫情。ASFV 是雙股線狀DNA 病毒，呈復(fù)雜的正二十面體結(jié)構(gòu)，可在低溫、高濕環(huán)境下長期生存，能適應(yīng)pH3～11 的寬泛酸堿環(huán)境[3-4]。ASFV粒子基因組大、易變異，編碼蛋白種類多；病毒存活力強(qiáng)，能夠通過多種方式和途徑進(jìn)行有效傳播，潛伏期因傳播方式而異，這是其在全球傳播的重要原因之一[5]。

1921 年，肯尼亞報(bào)道了全球首例ASF 疫情，隨后該病在多個(gè)國家和地區(qū)廣泛流行[6-7]，2018 年8 月，我國出現(xiàn)首例ASF 疫情，盡管有關(guān)部門迅速采取撲殺等控制措施，然而疫情仍蔓延至全國，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。由于ASFV的高致病性、傳染性和致死性，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病[10]。ASFV 核酸檢測是其防控工作的重要措施之一。自疫情發(fā)生以來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部先后發(fā)布了多項(xiàng)有關(guān)診斷試劑、病毒檢測和實(shí)驗(yàn)室管理方面的政策[11-15]。

根據(jù)北京市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局ASF 防控工作的有關(guān)要求，為確保北京市各ASF 實(shí)驗(yàn)室檢測標(biāo)準(zhǔn)的一致性和結(jié)果的可靠性，2020 年7 月，本實(shí)驗(yàn)室參加了北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心組織實(shí)施的ASF 實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對。參照SN/T 1559—2010標(biāo)準(zhǔn)[16]中的普通PCR 方法、熒光PCR 方法以及使用已取得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)文號的試劑盒[15]，對血清樣品開展檢測比對，以期為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室ASFV核酸檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品、試劑

能力比對血清樣品（5 個(gè)，編號分別為15、20、69、73、86），由北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供；DNA 病毒基因組提取試劑盒、ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒，均購自青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心；TaqMan PCR Master Mix、ExTaq聚合酶，均購自北京奧今東方科技有限公司；引物、探針和ASFV 核酸陽性質(zhì)粒，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2 儀器設(shè)備

Quant Studio 6 Flex 熒光定量PCR 儀、9700 PCR 儀，購自美國ABI 公司；INFINITY 3000 凝膠成像系統(tǒng)，購自法國Vilber 公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 參照DNA 病毒基因組提取試劑盒方法，提取樣品DNA。

1.3.2 普通PCR 檢測 使用SN/T 1559—2010 標(biāo)準(zhǔn)[16]中的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列見表1。每個(gè)反應(yīng)管中包含50.00 μL 反應(yīng)體系：1.25 mmol/L 的dNTP 8.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，終濃度0.40 pmol/L 的上下游引物各1.00 μL，DNA 模板5.00 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)齊至50.00 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。

1.3.3 熒光定量PCR 檢測 使用SN/T 1559—2010 標(biāo)準(zhǔn)[16]中的引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。每個(gè)反應(yīng)管中包含25.0 μL反應(yīng)體系：2×TaqMan PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，探針1.0 μL，DNA 模板5.0 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)齊至25.0 μL。熒光定量PCR 反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，58 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)。

表1 普通PCR 和熒光定量PCR 引物探針

1.3.4 ASFV 熒光PCR 試劑盒檢測 使用商品化試劑盒中的引物探針進(jìn)行熒光定量PCR 檢測，反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件均按說明書推薦操作進(jìn)行。

1.3.5 檢測過程質(zhì)量控制 每個(gè)反應(yīng)設(shè)置陽性、陰性及空白對照。其中SN/T 1559—2010 標(biāo)準(zhǔn)[16]中引物擴(kuò)增的陽性對照使用對應(yīng)序列合成的質(zhì)粒DNA，陰性對照為不含目標(biāo)基因的DNA，空白對照用無菌水代替。按標(biāo)準(zhǔn)和試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 普通PCR 檢測

PCR 擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖1）顯示：除陽性對照外，有4個(gè)樣品（20、69、73、86 號）PCR 結(jié)果呈陽性，陽性樣品與陽性對照一致，均擴(kuò)增得到278 bp 的特異性條帶，其中69 和73 號樣品擴(kuò)增強(qiáng)度較弱；15 號樣品無擴(kuò)增片段，檢測結(jié)果為陰性。

圖1 普通PCR 電泳圖

2.2 熒光PCR 檢測

熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，除陽性對照外，4 個(gè)樣品熒光PCR 檢測結(jié)果呈陽性，其中20、86 號樣品擴(kuò)增信號較強(qiáng)，Ct 值分別為22.8 和21.4；69、73 號樣品擴(kuò)增信號較弱，Ct 值分別為33.8和34.0。15號樣品無擴(kuò)增信號，無Ct值，結(jié)果判定為陰性。

圖2 熒光PCR 擴(kuò)增曲線

2.3 熒光PCR 商品試劑盒檢測

根據(jù)試劑盒結(jié)果判定要求，陽性對照Ct ＜30 且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對照無Ct 值或Ct ≥40，說明檢測結(jié)果有效。在此基礎(chǔ)上，被檢測樣品Ct ＜40 且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判定為陽性，結(jié)果與陰性對照一致的判定為陰性。檢測結(jié)果（圖3）顯示，陽性、陰性和空白對照均符合質(zhì)控要求。其中：20、86 號樣品擴(kuò)增信號較強(qiáng)，Ct 值分別為22.5 和22.9，判定為陽性；69、73 號樣品擴(kuò)增信號較弱，Ct 值分別為29.2 和29.4，判定為陽性；15 號樣品無擴(kuò)增信號，無Ct 值，判定為陰性。

圖3 ASFV 熒光PCR 商品試劑盒檢測結(jié)果

3 分析與討論

ASFV 實(shí)驗(yàn)室檢測是嚴(yán)防ASF 疫情發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。ASFV 核酸檢測的方法有普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、微滴數(shù)字PCR（ddPCR）、原位雜交（ISH）、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）和重組酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）等[17]。目前，ASFV 檢測的主要依據(jù)有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1559—2010《非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范》[16]、國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18648—2020《非洲豬瘟診斷技術(shù)》[18]以及OIETerrestrial Animal Health Code第2.8.1 章中ASFV 檢測方法[19]。其中PCR 技術(shù)因具有快速、高效等優(yōu)勢成為主流檢測手段。本次比對驗(yàn)證選擇行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的普通PCR、熒光定量PCR 和國家批準(zhǔn)的商品化試劑盒（熒光定量PCR 方法）相互驗(yàn)證。比對發(fā)現(xiàn)，3 種方法結(jié)果一致，驗(yàn)證結(jié)果為“滿意”。普通PCR 具備靈敏度高、成本低以及對樣本純度要求低等優(yōu)點(diǎn)，適合沒有熒光定量PCR 儀的基層實(shí)驗(yàn)室；但PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物需在開蓋后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以觀察特異性條帶，開蓋過程易造成交叉污染出現(xiàn)假陽性[20]。熒光定量PCR 特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高并且不易污染樣本和環(huán)境。商品化試劑盒將熒光定量PCR所需的試劑整合在一起，操作更加簡便，檢測結(jié)果一致性高，是ASFV 日常防控檢測和實(shí)驗(yàn)室比對的指定方法[15]。

選用SN/T 1559—2010 標(biāo)準(zhǔn)方法[16]開展檢測時(shí)，需獲得陽性對照。為防止病毒污染，宜選用含有目標(biāo)基因片段的陽性質(zhì)粒。將標(biāo)準(zhǔn)中的引物序列在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該引物的序列信息為ASFV 結(jié)構(gòu)蛋白基因p72，通過合成本段序列可獲得陽性質(zhì)粒[21]。因質(zhì)粒DNA 的拷貝數(shù)很高，實(shí)驗(yàn)室在使用過程中要防止污染，應(yīng)將質(zhì)粒DNA 適當(dāng)稀釋后分裝保存?zhèn)溆?。選用商品化試劑盒檢測時(shí)，要選用獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)文號的產(chǎn)品，以保證檢測結(jié)果的合法性和可靠性。因相關(guān)政策法規(guī)實(shí)時(shí)更新，產(chǎn)品批準(zhǔn)文號信息可在中國獸藥信息網(wǎng)“獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫”中隨用隨查。

比對驗(yàn)證是評價(jià)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的有效手段[22]。通過此次驗(yàn)證，進(jìn)一步確認(rèn)了實(shí)驗(yàn)室人員、儀器、方法以及環(huán)境各方面均需滿足ASFV 檢測要求。本次驗(yàn)證同時(shí)提高了檢測機(jī)構(gòu)的公信力，為及時(shí)發(fā)現(xiàn)和防控ASF 疫情提供了技術(shù)支撐。