廣東省廣州市豬禽屠宰場(chǎng)環(huán)境沙門氏菌血清分型與耐藥性分析

林本夫，潘婧淇，梁夢(mèng)詩(shī)，丘穗萍，袁曉琪，王夢(mèng)華，原麗紅

（1.廣州市花都區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東廣州 510800；2.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州 510006；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州 510000）

食源性疾病是當(dāng)前世界上最突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題，全球每年約有1/3 的人群患食源性疾病[1]，其中220 萬(wàn)人死亡，主要為兒童[2]。我國(guó)每年有2～3 億人次（即1/6 左右人口）患食源性疾病[3]。沙門氏菌是一類常見且危害較大的食源性致病菌，可通過(guò)環(huán)境污染食物而引發(fā)人類疾病。全球沙門氏菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)（WHO GSS）數(shù)據(jù)顯示，全球每年有1億多人感染沙門氏菌，死亡超過(guò)15 萬(wàn)人。我國(guó)大陸地區(qū)70%～80%的細(xì)菌性食物中毒由沙門氏菌引起，其中超過(guò)90%以家養(yǎng)畜禽、畜禽肉、禽蛋及其制品為傳播基質(zhì)，而肉制品沙門氏菌污染往往由屠宰、加工過(guò)程中的污染所致[4-7]。

廣東是豬禽養(yǎng)殖和消費(fèi)大省，也是食源性沙門氏菌病高發(fā)地區(qū)[8]。2018 年廣東省生豬出欄3 757.4 萬(wàn)頭，豬肉供應(yīng)量282 萬(wàn)t；2019 年全省生豬產(chǎn)能受非洲豬瘟及環(huán)保限養(yǎng)影響而大幅下降，但出欄總量和豬肉供應(yīng)量仍保持較高水平，分別為2 940.2 萬(wàn)頭和221.9 萬(wàn)t[9]。2019 年廣東省家禽年出欄量達(dá)12.12 億只，禽肉年產(chǎn)量176.24 萬(wàn)t[10]。前期研究（待發(fā)表），系統(tǒng)分析了廣州市禽類養(yǎng)殖、屠宰和銷售3 大環(huán)節(jié)沙門氏菌污染情況，以及各環(huán)節(jié)內(nèi)動(dòng)物-環(huán)境-職業(yè)人群3 大要素對(duì)沙門氏菌傳播擴(kuò)散的影響，發(fā)現(xiàn)屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌污染最嚴(yán)重（18.82%），其中環(huán)境污染是導(dǎo)致沙門氏菌傳播擴(kuò)散的主要因素。本研究對(duì)廣州市大型豬禽屠宰場(chǎng)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控，通過(guò)檢測(cè)場(chǎng)內(nèi)的空氣、土壤、污泥、暫養(yǎng)舍、屠宰車間、運(yùn)輸車等拭子樣品中沙門氏菌分布情況，評(píng)估場(chǎng)內(nèi)沙門氏菌污染主要因素，通過(guò)血清型分析和藥敏試驗(yàn)，對(duì)比分析廣州市豬禽屠宰場(chǎng)沙門氏菌的主要血清型和耐藥譜，旨在為基層沙門氏菌病防控，降低沙門氏菌污染導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（CRM004）、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、MHA 干粉，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司；引物，由生工生物科技（上海）有限公司合成；1.1×T3 Super PCR Mix、TS-GelRed 核酸凝膠染料、DL 2 000 DNA Marker、DL 5 000 DNA Marker、瓊脂粉，購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司；PCR 產(chǎn)物回收試劑盒，購(gòu)自TaKaRa 生物工程有限公司。沙門氏菌診斷血清，購(gòu)自泰國(guó)S&A 公司；12 種抗生素藥敏片（直徑6 mm），購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，包括慶大霉素（GEN）、諾氟沙星（NFX）、氟苯尼考（FFC）、環(huán)丙沙星（CIP）、阿莫西林（AMX）、頭孢噻吩（CEF）、頭孢噻肟（CTX）、氨芐西林（AMP）、頭孢曲松（CRO）、頭孢他啶（CAZ）、氨曲南（ATM）、亞胺培南（IPM）。

1.2 樣品采集

2019 年5 月，在廣州市某區(qū)的2 個(gè)大型生豬屠宰場(chǎng)和3 個(gè)禽類屠宰場(chǎng)采集環(huán)境樣品268 份，包括空氣、土壤、污泥樣品，以及其他環(huán)境拭子樣品（如運(yùn)輸車輛、待宰圈/舍、屠宰車間等）。采集方法如下：（1）空氣樣品。分別在屠宰車間、待宰圈/舍、辦公室3 個(gè)采樣點(diǎn)通風(fēng)處約1.5 m 高處架設(shè)SKC空氣采樣器，0.5% BSA/PBS 緩沖液以8 mL/h 流速，110 V采樣12 h/d，記為1份空氣樣品，連續(xù)采集3 d。（2）土壤樣品。分別在豬禽屠宰場(chǎng)入口、屠宰車間、待宰圈舍等空間，按梅花形采樣法采集土壤樣品，5～10 g/份。（3）污泥樣品。在排污池四角處分別采集池內(nèi)污水約10 mL/份。（4）環(huán)境拭子樣品。用無(wú)菌棉拭子分別在屠宰車間、待宰圈/舍以及豬禽運(yùn)輸車輛采集環(huán)境樣品，每個(gè)空間或車輛采集5份拭子樣品，分別放入無(wú)菌0.5% BSA/PBS 緩沖液中保存。所有樣品采集后于4 ℃保存，用冰盒低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行沙門氏菌分離培養(yǎng)。

1.3 樣品池準(zhǔn)備

為分析不同空間（屠宰、待宰、辦公）、不同類型（空氣、土壤、污泥等）樣品沙門氏菌污染情況，將同一空間內(nèi)采集的同一類型樣品合并，制備樣品池用于沙門氏菌檢測(cè)：（1）將每個(gè)采樣點(diǎn)連續(xù)3 d 采集的空氣樣品合并，記為1 個(gè)樣品池；（2）將每個(gè)空間采集的土壤樣品合并為1 個(gè)樣品池；（3）將每個(gè)排污池采集的污泥樣品合并為1個(gè)樣品池；（4）將每個(gè)空間或車輛采集的環(huán)境拭子合并為1 個(gè)樣品池。

1.4 沙門氏菌分離驗(yàn)證

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2016，將每個(gè)樣品池樣品接種于15 mL 緩沖蛋白胨水BPW，于37 ℃180 r/min 過(guò)夜，進(jìn)行預(yù)增菌；各取1 mL 預(yù)增菌樣品分別轉(zhuǎn)種于10 mL TTB（42 ℃，18～24 h）和10 mL SC（37 ℃，18～24 h）進(jìn)行增菌；增菌后，用接種環(huán)分別取TTB 增菌液和SC 增菌液劃線接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（CRM004）平板，每個(gè)樣品重復(fù)劃線接種3 次，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；對(duì)TTB、SC雙陽(yáng)性樣品，挑取品紅（紫）色單菌落劃線接種于BS 培養(yǎng)板進(jìn)行復(fù)篩，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取棕色/墨綠色/黑色有金屬光澤的單菌落接種于10 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，用于PCR 擴(kuò)增測(cè)序。

利用沙門氏菌特異引物（InvA-F：gtgaaattatcgccacgttcgggcaa/InvA-R：tcatcgcaccgtcaaaggaacc）[11]，對(duì)疑似陽(yáng)性菌落進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物（約284 bp 條帶）送生工生物科技（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。PCR 體系擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 沙門氏菌血清分型

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2016 和沙門氏菌診斷血清產(chǎn)品說(shuō)明書，對(duì)PCR 鑒定陽(yáng)性的沙門氏菌菌株進(jìn)行血清型鑒定：首先用O 多價(jià)血清進(jìn)行凝集反應(yīng)，如果菌株與O 多價(jià)血清發(fā)生凝集，則繼續(xù)使用O 多價(jià)血清中包含的相應(yīng)群血清進(jìn)行測(cè)定；如果菌株與某一O 群血清發(fā)生凝集，則繼續(xù)使用該群包含的單因子抗血清進(jìn)行測(cè)試。確定O 抗原血清型后，依次用H 多價(jià)抗血清測(cè)定H 血清型。

1.6 沙門氏菌藥敏分析

根據(jù)行標(biāo)WS/T 639—2018，取過(guò)夜培養(yǎng)的沙門氏菌菌液（約1.5×108CFU/mL）均勻涂布于MHA 瓊脂平板（內(nèi)徑14 cm，厚度3～4 mm）；待菌液干燥后用無(wú)菌鑷子將藥敏片（6 mm）緊密貼于培養(yǎng)基上，各藥敏片中心相距2.5 cm 以上；平皿于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)域的直徑（含藥敏片），根據(jù)藥敏片說(shuō)明書提供的參考數(shù)值判定抑菌情況。

2 結(jié)果

2.1 樣品采集與沙門氏菌分離

從生豬屠宰場(chǎng)和禽類屠宰場(chǎng)共采集空氣、土壤等各類環(huán)境樣品268 份，組成各類樣品池55 個(gè)。通過(guò)國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2016 對(duì)樣品進(jìn)行沙門氏菌分離培養(yǎng)，結(jié)合PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，共獲得10 個(gè)沙門氏菌陽(yáng)性樣品池（生豬屠宰場(chǎng)7 個(gè)、禽類屠宰場(chǎng)3個(gè)），總檢出率為18.18%（表1）。獨(dú)立樣本卡方分析顯示，豬禽屠宰場(chǎng)之間沙門氏菌污染率無(wú)顯著差異（P＞0.05），而不同類型樣品之間沙門氏菌污染率差異顯著（P＜0.05），其中排污池污泥樣品污染最嚴(yán)重（75.00%），土壤和屠宰車間次之。

2.2 沙門氏菌血清分型

通過(guò)沙門氏菌O/H 多價(jià)和單因子血清分型鑒定，10 株沙門氏菌共鑒定到5 種血清型，包括鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium，n=5）、腸炎沙門氏菌（S.enteritidis，n=2）、德爾卑沙門氏菌（S.derby，n=2）和蒙得維的亞沙門氏菌（S.montevideo，n=1）。其中：分離自豬屠宰場(chǎng)的7 株沙門氏菌中，有5 株鼠傷寒沙門氏菌、1 株德爾卑沙門氏菌、1 株蒙得維的亞沙門氏菌；來(lái)自禽屠宰場(chǎng)的3 株沙門氏菌中，有2 株腸炎沙門氏菌、1 株為德爾卑沙門氏菌。詳見表2。

2.3 藥敏分析

本研究選擇12 種臨床常用抗生素根據(jù)行標(biāo)WS/T 639—2018，對(duì)10 株豬禽屠宰場(chǎng)分離到的沙門氏菌進(jìn)行藥敏分析。結(jié)果顯示：10 株沙門氏菌對(duì)阿莫西林和氨芐西林兩種抗生素完全抗藥，對(duì)亞胺培南完全敏感；豬屠宰場(chǎng)分離到的7 株沙門氏菌與禽屠宰場(chǎng)分離的3 株沙門氏菌對(duì)抗生素敏感的種類相似（表3）。

表1 環(huán)境樣本沙門氏菌檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表2 沙門氏菌血清型鑒定

3 種來(lái)自豬屠宰場(chǎng)的沙門氏菌血清型至少對(duì)2種以上抗生素產(chǎn)生抗藥性，其中3 株鼠傷寒沙門氏菌對(duì)3 種或4 種抗生素產(chǎn)生抗藥性，而德爾卑沙門氏菌對(duì)4 種抗生素同時(shí)耐藥。此外，兩種來(lái)自禽屠宰場(chǎng)的沙門氏菌血清型也均對(duì)2 種及以上抗生素產(chǎn)生抗藥，其中德爾卑沙門氏菌對(duì)5 種抗生素同時(shí)耐藥（表4）。不同血清型沙門氏菌對(duì)慶大霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、阿莫西林、氨芐西林5 種抗生素的抗藥情況嚴(yán)重，其中所有血清型對(duì)阿莫西林和氨芐西林完全抗藥；豬屠宰場(chǎng)分離的1 株沙門氏菌對(duì)慶大霉素、氟苯尼考、阿莫西林、氨芐西林4 種抗生素完全抗藥，禽屠宰場(chǎng)分離的1 株沙門氏菌對(duì)慶大霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、阿莫西林、氨芐西林5 種抗生素完全抗藥（表4）。

表3 沙門氏菌抗生素耐藥性分析結(jié)果

表4 沙門氏菌血清型與抗藥性分析 %

3 討論

沙門氏菌是一類廣泛分布的食源性致病菌。人主要通過(guò)食入被其污染的食品而感染，一旦接觸并攝入大量沙門氏菌（105～106個(gè)/g）就會(huì)引起細(xì)菌性感染，進(jìn)而在毒素作用下發(fā)生食物中毒。被沙門氏菌污染的肉、蛋等制品是沙門氏菌病的主要傳染源，而被沙門氏菌污染的環(huán)境（如土壤、籠舍、砧板等）是導(dǎo)致肉、蛋污染的主要因素[5]。因此，做好環(huán)境沙門氏菌污染的控制，可有效阻斷沙門氏菌的傳播途徑，保障人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

張華寧等[6]和李薇薇等[7]分別對(duì)山東、四川兩省的肉雞孵化、養(yǎng)殖、屠宰、流通等環(huán)節(jié)沙門菌污染程度進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌污染情況最嚴(yán)重，分別達(dá)到27.0% 和24.9%。趙格等[12]的研究數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)部分地區(qū)屠宰環(huán)節(jié)豬肉中沙門氏菌污染率達(dá)到32.9%。劉鮮鮮等[11]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，山東省部分生豬屠宰場(chǎng)沙門氏菌污染率為12.0%～34.6%。本研究發(fā)現(xiàn)，廣州市豬禽屠宰場(chǎng)沙門氏菌污染率分別為21.86%、13.04%，表明禽類屠宰場(chǎng)情況略好于生豬屠宰場(chǎng)，然而二者無(wú)顯著差異；進(jìn)一步分析表明，不同類型樣品之間沙門氏菌污染情況差異顯著，污泥、土壤、屠宰車間是屠宰場(chǎng)沙門氏菌污染、擴(kuò)散的主要環(huán)節(jié)。因此，豬禽屠宰場(chǎng)沙門氏菌控制重點(diǎn)應(yīng)放在污水、場(chǎng)區(qū)地面以及屠宰車間的消毒和處理。

李月華等[13]對(duì)我國(guó)部分地區(qū)豬、禽源沙門氏菌的血清型分析結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門氏菌（58.43%）和腸炎沙門氏菌（59.69%）分別為豬、禽沙門氏菌優(yōu)勢(shì)血清型。陳健皓[14]在對(duì)豬源、雞源沙門氏菌的分子溯源中發(fā)現(xiàn)，豬源和雞源沙門氏菌分別以德爾卑（10.48%）和腸炎（50.00%）沙門氏菌為主。岳秀英等[15]對(duì)四川省豬場(chǎng)拭子樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，德爾卑沙門氏菌（60.26%）為主要血清型，其次為鼠傷寒（16.56%）和里森（6.60%）沙門氏菌。劉鮮鮮等[11]對(duì)山東省部分生豬屠宰場(chǎng)屠宰環(huán)節(jié)進(jìn)行沙門氏菌血清型鑒定發(fā)現(xiàn)，屠宰環(huán)節(jié)以德爾卑（39.60%）、鼠傷寒（27.72%）、湯卜遜（16.83%）等沙門氏菌為主，而其中魯東、西部地區(qū)鼠傷寒沙門菌為優(yōu)勢(shì)型，東北部地區(qū)和西南部以德爾卑沙門氏菌為優(yōu)勢(shì)型，中部地區(qū)則是湯卜遜沙門氏菌。楊盛智等[16]對(duì)四川省雞肉和雞蛋生產(chǎn)加工中的沙門氏菌血清型鑒定發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門氏菌（44.1%）為主要血清型，其次為德爾卑（19.5%）和鼠傷寒（9.7%）沙門氏菌；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在不同生產(chǎn)鏈環(huán)節(jié)中，優(yōu)勢(shì)血清型也不一致，如養(yǎng)殖環(huán)節(jié)優(yōu)勢(shì)型為腸炎沙門氏菌，而雞蛋生產(chǎn)過(guò)程中為德爾卑沙門氏菌。本研究結(jié)果顯示，廣州市豬禽屠宰場(chǎng)分離的沙門氏菌以鼠傷寒和腸炎沙門氏菌為主，其次為德爾卑沙門氏菌。近年來(lái)相關(guān)研究表明，鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌在不同地區(qū)豬禽產(chǎn)業(yè)鏈的不同環(huán)節(jié)分布廣泛，是食源性沙門氏菌主要致病菌，應(yīng)進(jìn)行針對(duì)性防控。

本研究從豬禽屠宰場(chǎng)分離到的10 株沙門氏菌，對(duì)阿莫西林、氨芐西林2 種抗生素完全抗藥（耐藥率100%），對(duì)亞胺培南完全敏感（高敏率100%），對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻吩、氨曲南4 種抗生素高度敏感（高敏率＞57%），對(duì)諾氟沙星、氟苯尼考2 種抗生素較敏感；85.7%豬源和66.7%禽源沙門氏菌對(duì)2 種以上抗生素耐藥，其中豬源德爾卑沙門氏菌對(duì)4 種抗生素耐藥，禽源德爾卑沙門氏菌對(duì)5 種抗生素耐藥。夏宇飛等[17]對(duì)湖南省的豬源與雞源沙門氏菌抗藥性分析結(jié)果顯示，豬源和禽源沙門氏菌對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺異惡唑具有很強(qiáng)的耐藥性（＞62%），對(duì)阿莫西林/克拉維酸、氟苯尼考耐藥率在40%左右，無(wú)菌株對(duì)乙酰甲喹、安普霉素耐藥；多重耐藥性分析結(jié)果顯示，每株菌至少對(duì)1 種抗生素耐藥，最高出現(xiàn)13 重耐藥菌株。岳秀英等[15]的研究結(jié)果顯示，豬養(yǎng)殖場(chǎng)沙門氏菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、大觀霉素、四環(huán)素、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明和恩諾沙星7 種藥物的耐藥率最高（＞86%），對(duì)頭孢噻呋和多粘菌素E 相對(duì)敏感。張珍[18]對(duì)雞沙門氏菌的毒力基因和致病性研究中發(fā)現(xiàn)，分離到的55 株沙門氏菌均對(duì)利福平、阿莫西林、青霉素G、苯唑西林以及頭孢噻吩的耐藥率達(dá)到100%，對(duì)紅霉素、林可霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明及呋喃妥因耐藥率達(dá)到90%以上，對(duì)強(qiáng)力霉素、鏈霉素及諾氟沙星的耐藥率為50%～90%，對(duì)慶大霉素及大觀霉素較為敏感（耐藥率＜10%）。崔苗苗等[19]研究發(fā)現(xiàn)，雞腸炎沙門氏菌對(duì)頭孢噻呋、恩諾沙星、氧氟沙星、沙拉沙星高度敏感。綜合近年豬禽產(chǎn)業(yè)鏈沙門氏菌抗藥性分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌普遍對(duì)阿莫西林、氨芐西林這2 種抗生素高度耐藥，表明這2 種抗生素不適合在基層用于沙門氏菌病治療，而亞胺培南、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻吩、氨曲南等抗生素仍保持較高的抑菌率，適合在基層使用。

本研究對(duì)廣州市大型豬禽屠宰企業(yè)環(huán)境進(jìn)行沙門氏菌監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)豬禽屠宰場(chǎng)沙門氏菌污染情況較為嚴(yán)重，污泥、土壤、屠宰車間是沙門氏菌污染擴(kuò)散的主要環(huán)節(jié)，應(yīng)作為日常消毒的重點(diǎn)。此外，屠宰場(chǎng)分離的沙門氏菌優(yōu)勢(shì)血清型為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，所有菌株對(duì)阿莫西林、氨芐西林2 種抗生素完全抗藥，但對(duì)亞胺培南、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻吩、氨曲南5 種抗生素高度敏感，因此基層可選用上述高度敏感的5 類抗生素作為沙門氏菌病的治療用藥。