基于可編程邏輯控制器的超聲陣列輔助酶解控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)

丁艷華 馬海樂(lè) 曲文娟 肖 鳳

(1. 江蘇大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者[1-4]將超聲技術(shù)應(yīng)用于生物酶解，通過(guò)超聲空化效應(yīng)增強(qiáng)酶解底物與酶的接觸，使酶解效果得到了明顯改善。超聲作用時(shí)采用的頻率模式和作用時(shí)間是影響其效果的重要參數(shù)。已有學(xué)者[5-7]指出，當(dāng)給定超聲頻率接近反應(yīng)系統(tǒng)的共振頻率時(shí)，輸出的化學(xué)產(chǎn)額接近最大，因此采用多頻模式更容易找到與處理系統(tǒng)匹配的諧振頻率，產(chǎn)生較好的超聲處理效果。然而，目前有關(guān)超聲輔助酶解的報(bào)道[8-9]中使用最多的是單頻和雙頻，三頻及以上的復(fù)合頻率使用較少，因此，超聲在酶解中的應(yīng)用受到限制。

另外，目前大多超聲輔助酶解系統(tǒng)多為手動(dòng)操作，酶解產(chǎn)物的理化特性、生物活性等指標(biāo)需要離線測(cè)定化學(xué)值進(jìn)行判斷，需要多次采樣測(cè)定，耗時(shí)、耗力，而且酶解終點(diǎn)無(wú)法及時(shí)判斷，易造成酶解不足或過(guò)度酶解?；谝陨蠁?wèn)題，試驗(yàn)擬設(shè)計(jì)S型五頻超聲陣列的多頻多模式頻率控制，并將近紅外光譜原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與可編程邏輯控制器(Programmable logic controller，PLC)控制技術(shù)相結(jié)合，以期實(shí)現(xiàn)酶解終點(diǎn)的自動(dòng)控制。

1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及方案設(shè)計(jì)

1.1 整體結(jié)構(gòu)

以PLC為主控制器的S型五頻超聲陣列輔助酶解系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

系統(tǒng)的工作過(guò)程：將需要酶解的料液置于酶解槽內(nèi)，選擇超聲模式，再加入反應(yīng)酶并啟動(dòng)超聲設(shè)備開(kāi)始酶解。酶解過(guò)程中將光譜數(shù)據(jù)發(fā)送到上位機(jī)，利用Matlab軟件建立預(yù)測(cè)模型，將模型計(jì)算得到的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)抑制率預(yù)測(cè)值進(jìn)行迭代計(jì)算，若達(dá)到目標(biāo)值，利用PC ACCESS改寫(xiě)對(duì)應(yīng)的變量存儲(chǔ)器狀態(tài)，終止酶解，進(jìn)行后續(xù)的滅酶工作。

1. 上位機(jī)(計(jì)算機(jī)) 2. PLC 3. 觸摸屏 4. 近紅外光譜儀 5. 20 kHz超聲電源 6. 28 kHz超聲電源 7. 35 kHz超聲電源 8. 40 kHz超聲電源 9. 50 kHz超聲電源 10. 20 kHz超聲反應(yīng)腔 11. 28 kHz超聲反應(yīng)腔 12. 35 kHz超聲反應(yīng)腔 13. 40 kHz超聲反應(yīng)腔 14. 50 kHz超聲反應(yīng)腔 15. 橡膠管 16. 燒杯 17. 水浴鍋 18. 蠕動(dòng)泵圖1 S型五頻超聲陣列輔助酶解系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Figure 1 Structure of S-type five-frequency ultrasound-array-assisted enzymatic hydrolysis system

1.2 硬件配置

1.2.1 控制器配置 系統(tǒng)的主控制器采用西門(mén)子公司生產(chǎn)的S7-200 PLC。該款控制器性能穩(wěn)定，抗干擾能力強(qiáng)，編程方便、指令豐富、可實(shí)現(xiàn)多種先進(jìn)控制算法[10-11]，主要包括CPU、存儲(chǔ)器、輸入輸出接口、電源和通信模塊。PLC配置如表1所列。

1.2.2 人機(jī)交互裝置 人機(jī)界面采用西門(mén)子Smart 700觸摸屏。模塊采用高端的ARM處理器，數(shù)據(jù)處理速度快，畫(huà)面切換流暢。與上位機(jī)通過(guò)PC/PPI連接進(jìn)行通信，組態(tài)好、項(xiàng)目傳送完畢后通過(guò)RS485端口連接到S7-200 PLC編程口建立二者通信。

表1 S7-200 PLC配置

1.2.3 S型五頻超聲陣列 S型五頻超聲陣列共有20，28，35，40，50 kHz 5種頻率。頻率可設(shè)定為單頻、雙頻和三頻。設(shè)計(jì)的頻率組合如表2所示。組合頻率(雙頻和三頻)可為同步或順序兩種工作模式。同步模式為2種或3種頻率超聲同時(shí)工作，順序模式為2種或3種頻率超聲依次按照順序工作。

表2 五頻超聲陣列頻率模式?

超聲結(jié)構(gòu)為腔式，超聲換能器直接作用于反應(yīng)腔。將開(kāi)始酶解的料液通過(guò)蠕動(dòng)泵送入超聲腔，從超聲腔的下管進(jìn)上管出，自下而上的循環(huán)使超聲處理更均勻。使用多種頻率組合時(shí)，將不同超聲反應(yīng)腔上的物料管依次串聯(lián)相接，類(lèi)似S型。每臺(tái)超聲波發(fā)生器均設(shè)有遠(yuǎn)程控制端口，因此PLC可對(duì)發(fā)生器電源內(nèi)部嵌入式芯片發(fā)送高、低電平，由此決定超聲波換能器是否發(fā)出超聲波。

1.2.4 近紅外光譜采集 近紅外光譜所反應(yīng)的主要是含氫基團(tuán)的信息，因此在分子的結(jié)構(gòu)識(shí)別尤其是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的定性及定量分析中具有較強(qiáng)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)[12-13]。選用美國(guó)海洋光學(xué)(上海)有限公司的NIRQUEST型近紅外光譜儀，采用對(duì)近紅外光靈敏度比較高的InGaAs檢測(cè)器，波長(zhǎng)范圍900～2 500 nm，如圖2所示。

1.3 超聲陣列控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)

1.3.1 超聲工作模式控制流程 根據(jù)表2所列的超聲陣列頻率模式，設(shè)計(jì)PLC控制系統(tǒng)。地址分配表見(jiàn)表3。順序流程圖見(jiàn)圖3。系統(tǒng)通電后，首先上電初始化。再通過(guò)觸摸屏中模式選擇變量指定一種頻率模式，進(jìn)入選擇性分支。第一分支為單頻模式，選定一種頻率，設(shè)置超聲時(shí)間和間歇時(shí)間(單位為s)，間歇時(shí)間是超聲工作和停止的比例，最后啟動(dòng)超聲。第二和第三分支對(duì)應(yīng)雙頻和三頻模式。雙頻和三頻的順序模式下需要設(shè)置不同頻率工作的具體時(shí)間，稱(chēng)為交替時(shí)間。

1. 恒溫水浴鍋 2. 電動(dòng)攪拌器 3. 水浴燒杯 4. 光纖 5. 鐵架 6. 光源 7. 近紅外光譜儀圖2 近紅外光譜采集裝置Figure 2 Near-infrared spectroscopy acquisition device

表3 PLC的變量地址分配

圖3 超聲陣列模式控制流程圖Figure 3 Flow chart of ultrasound-array mode control

1.3.2 人機(jī)界面設(shè)計(jì) 根據(jù)超聲模式控制流程設(shè)計(jì)終端控制人機(jī)界面。觸摸屏組態(tài)軟件為Wincc flexible。該設(shè)計(jì)共組態(tài)了4個(gè)畫(huà)面，分別為模式選擇主界面、單頻、雙頻和三頻模式。其中主界面如圖4所示。

1.4 酶解過(guò)程光譜采集

將采集的光譜建立數(shù)學(xué)模型對(duì)化學(xué)值進(jìn)行預(yù)測(cè)，建模時(shí)首先要建立校正模型和預(yù)測(cè)模型。酶解樣品中共采集90個(gè)光譜，采集光譜的同時(shí)采樣，離線測(cè)定化學(xué)值。

圖4 觸摸屏主界面Figure 4 Home interface of touch screen

采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，在數(shù)學(xué)與建模專(zhuān)業(yè)軟件Matlab中完成近紅外光譜原位監(jiān)測(cè)。

2 酶解試驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 材料、試劑與儀器

大米蛋白：總蛋白含量79%，西安金碩果業(yè)有限公司；

堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 LFG)：酶活2×105U/mL，諾維信(南京)生物技術(shù)有限公司；

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)：實(shí)驗(yàn)室自制；

馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hippury1-His-Leu，HHL)：美國(guó)Sigma公司；

可編程控制器：S7-200型，上?？伉欁詣?dòng)化設(shè)備有限公司；

超聲陣列：S型，課題組自主研制；

電動(dòng)攪拌器：JJ-1型，江蘇金壇市中大儀器廠；

離心機(jī)：LD5-2A型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

近紅外光譜儀：NIRQUEST型，美國(guó)海洋光學(xué)(上海)有限公司。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 酶解方法 據(jù)課題組已有研究成果，低頻超聲相對(duì)高頻對(duì)大米蛋白輔助酶解處理效果更好[14]，因此選擇單頻28 kHz連續(xù)模式；順序雙頻20 kHz/28 kHz，2種頻率的超聲時(shí)間各6 s和順序三頻20 kHz/28 kHz/35 kHz，3種頻率的超聲時(shí)間各4 s。

用燒杯配置濃度為40 g/L的大米蛋白懸浮液(溶解介質(zhì)為3 mmol/L的稀堿溶液)1 500 mL。將大米蛋白懸浮液在50 ℃的水浴中攪拌平衡10 min，用1 mol/L的NaOH將pH值調(diào)節(jié)到8.5，立即加入堿性蛋白酶，加酶量2.4 mL/L。開(kāi)始酶解后將懸浮液通過(guò)蠕動(dòng)泵在超聲腔中循環(huán)。每個(gè)超聲波發(fā)生器的額定功率為300 W，酶解時(shí)長(zhǎng)為90 min，酶解過(guò)程中每間隔3 min采集一次樣品，3種模式共采集樣品90個(gè)。將采集的樣品離心后取上清液，冷藏備用。

2.2.2 光譜采集方法 將光譜儀插入式光纖探頭置于酶解料液，在Ocean View軟件中設(shè)置采集條件：波長(zhǎng)范圍為800～2 500 nm，背景為蒸餾水，透射方式，光程為4 mm，掃描次數(shù)為10次，分辨率選定6.4 nm，共有256個(gè)變量。每個(gè)樣本連續(xù)采集3次光譜，取其平均值作為該樣本的原始光譜。酶解過(guò)程中每3 min采集一次光譜，與實(shí)時(shí)取樣一致。背景光譜的采集條件除了將酶解料液換成蒸餾水外，其他與酶解時(shí)條件一致。光譜數(shù)據(jù)以文本格式發(fā)送至上位機(jī)。

2.2.3 ACE抑制率測(cè)定 將酶解過(guò)程中采集的90個(gè)樣品按照吳瓊英等[15]的方法測(cè)定ACE抑制活性。取10 μL 酶解液的上清液溶于25 μL的ACE溶液，37 ℃下預(yù)熱10 min，加入HHL溶液后反應(yīng)30 min，之后立即加入1 mol/L 的HCl溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)溶液利用高效液相色譜儀分析并測(cè)定馬尿酸的生成量。用雙蒸餾水代替酶解產(chǎn)物作為空白樣。ACE抑制率的計(jì)算公式為：

(1)

式中：

IACE——血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率，%；

A1——空白樣對(duì)照中馬尿酸的面積，mAU·s；

A2——加入大米蛋白酶解產(chǎn)物樣品的馬尿酸的峰面積，mAU·s。

2.2.4 模型建立與終點(diǎn)控制 將采集的90個(gè)光譜進(jìn)行多元散射校正預(yù)處理，以消除散射影響。再將光譜集分為校正集(75個(gè))和預(yù)測(cè)集(15個(gè))，采用聯(lián)合區(qū)間最小二乘法結(jié)合實(shí)際測(cè)得的ACE抑制率建立校正模型和預(yù)測(cè)模型，方法參照文獻(xiàn)[16]。對(duì)采集到的光譜進(jìn)行預(yù)處理后篩選區(qū)間，建立校正模型。再對(duì)需要預(yù)測(cè)的樣品酶解，過(guò)程中采集光譜并進(jìn)行平滑處理，然后利用已經(jīng)建立的校正模型(預(yù)測(cè)模型)進(jìn)行預(yù)測(cè)。酶解過(guò)程的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流程如圖5所示。

將得到的ACE抑制率預(yù)測(cè)值在Matlab中進(jìn)行迭代運(yùn)算。終點(diǎn)控制以?xún)蓚€(gè)參數(shù)為指標(biāo)，一個(gè)為n個(gè)ACE抑制率預(yù)測(cè)值的平均值，另一個(gè)為相鄰兩個(gè)ACE抑制率預(yù)測(cè)值平均值的差，計(jì)算公式如式(2)和式(3)所示。

(2)

(3)

式中：

xi——第i次預(yù)測(cè)值；

em——相鄰兩次預(yù)測(cè)值的平均值之差。

圖5 酶解過(guò)程的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流程Figure 5 Flow of In-situ real-time monitoring inenzymatic hydrolysis process

圖6 終點(diǎn)判斷流程Figure 6 End-point determination process

2.3 結(jié)果與分析

將建立的模型應(yīng)用于酶解過(guò)程，對(duì)實(shí)時(shí)采集的光譜預(yù)測(cè)化學(xué)值。圖7為單頻、雙頻和三頻模式下在酶解終點(diǎn)時(shí)得到的ACE抑制率預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值對(duì)比圖。超聲輔助酶解控制系統(tǒng)在28 kHz單頻時(shí)酶解時(shí)長(zhǎng)為78 min，終點(diǎn)時(shí)的ACE抑制率預(yù)測(cè)值為65%，實(shí)測(cè)值為63.67%，27組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)系數(shù)R2值0.842 6。順序雙頻20 kHz/28 kHz模式下得到酶解時(shí)長(zhǎng)為72 min，終點(diǎn)時(shí)的ACE抑制率為68.70%，預(yù)測(cè)值為60%，25組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)系數(shù)R2值為0.889 6。順序三頻20 kHz/28 kHz/35 kHz模式下得到酶解時(shí)長(zhǎng)為105 min，終點(diǎn)時(shí)的ACE抑制率為65.72%，預(yù)測(cè)值為61%，36組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)系數(shù)R2值為0.901 6?？梢钥闯觯?種模式下的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值相關(guān)性均較高，預(yù)測(cè)效果良好。以ACE抑制率為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)3種頻率模式中順序雙頻20 kHz/28 kHz 的酶解效果最好，時(shí)間最短，抑制率最高。

圖7 ACE抑制率的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值Figure 7 Predictive value and measured value of ACE inhibitory rate

3 結(jié)論

試驗(yàn)以可編程邏輯控制器為核心，對(duì)超聲陣列輔助酶解過(guò)程進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化，通過(guò)人機(jī)交互終端操作，完成了超聲的多模式快速選擇與切換。同時(shí)，將化學(xué)計(jì)量學(xué)方法—近紅外光譜原位監(jiān)測(cè)、Matlab數(shù)學(xué)運(yùn)算與通信和可編程邏輯控制技術(shù)結(jié)合，完成了大米蛋白超聲輔助酶解過(guò)程中以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率為指標(biāo)的終點(diǎn)控制，改善了傳統(tǒng)酶解需要離線測(cè)定化學(xué)值、效果不可預(yù)知的狀況。該系統(tǒng)為超聲輔助酶解過(guò)程提供了多種模式，后期考慮將該系統(tǒng)應(yīng)用于不同蛋白酶在植物蛋白酶解過(guò)程中的柔性切換的控制，以達(dá)到更好的酶解效果。